目标：
本研究的目的是验证用于检测拭子及冲洗样本中微量原料药（API）含量的分析方法，同时建立相应的文件记录，并制定相应的操作程序。
该范围应评估用于通过高效液相色谱法（HPLC）测定拭子和冲洗样本中微量原料药（API）含量的分析方法的适用性。本方案应明确测定拭子和冲洗样本中微量API含量的程序、文件记录要求、参考资料、验收标准以及评估结果。
职责：
分析研发部门
质量控制部门：
法规事务部门
质量保证部门：
验证团队与审批部门
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培训：
应当对相关人员提供培训，并保存培训记录。
分析方法程序及溶液制备的详细信息：
测试程序；检测流程
详细的测试程序遵循 IP/BP/USP/IH 的规定。
描述： 产品的通用名称
**测定；确定** 通过高效液相色谱法（HPLC）
所需试剂：
原料药 / 工作标准品 / 杂质
原料药名称
安慰剂
设备；仪器
清洁干燥的A级玻璃器皿：容量瓶、吸管、拭子、试管 SS板（10 X 10厘米的316L不锈钢板）
缓冲溶液的配制：
流动相制备：
色谱条件：
仪器：
列
波长
流速
列温度：
注射体积：
运行时间
稀释剂
溶液的制备：
空白溶液配制（稀释剂）
标准溶液配制：
清洁样品溶液的制备：
将拭子样本浸泡在5.0毫升的稀释液中，然后进行约10分钟的超声处理。将溶液通过0.45微米的注射过滤器过滤后，注入HPLC系统。
对于冲洗样品：
将冲洗样品通过0.45微米的注射器过滤器过滤，弃去最初的几毫升液体，然后填充到HPLC小瓶中并注入HPLC系统。
程序；步骤；操作规程
用流动相平衡色谱柱30-45分钟。分别进样空白溶液（一次）、标准溶液（五次）和样品溶液（一次），并记录主峰及其他相关峰的响应值。
系统适用性:
[if !supportLists]1. 注入空白溶液。忽略测试溶液中由于空白溶液而产生的任何峰值。
[if !supportLists]2. 标准溶液的API峰面积在五次重复注射中的相对标准偏差（RSD）不应超过2.0%。
计算；核算
使用以下公式计算冲洗样品中原料药（API）的浓度（以 ppm 为单位）。
“Where...”
AT = 洗涤样品溶液中原料药的含量（面积单位）
A由于提供的文本 "s" 是一个字母，没有具体的含义或上下文，因此无法进行准确的翻译。请提供更多的信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 = 标准溶液中原料药（API）的平均面积
W由于提供的内容仅为“s”这一个字符，无法进行有效的翻译。请提供更完整的文本或术语，以便我能够为您提供准确的翻译服务。 = 取用的标准品重量（毫克）
D由于提供的文本 "s" 是一个字母，没有具体的含义或上下文，因此无法进行准确的翻译。请提供更多的信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 = 标准品的稀释
P = 原料药的纯度（按现状计算）
使用以下方法计算拭子样本中原料药（API）的含量：
配方；配方成分
“Where...”
AT = 原料药（API）的面积 拭子样本溶液
A由于提供的文本 "s" 是一个字母，没有具体的含义或上下文，因此无法进行准确的翻译。请提供更多的信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 = 标准溶液中原料药（API）的平均面积
W由于提供的内容仅为“s”这一个字符，无法进行有效的翻译。请提供更完整的文本或术语，以便我能够为您提供准确的翻译服务。 = 取用的标准品重量（毫克）
D由于提供的文本“s”是一个字母，没有具体的含义或上下文，我无法为其生成准确的中文翻译。请提供更多的信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 = 标准品的稀释
V = 拭子样本的最终体积（5毫升）
P = 原料药（API）的纯度（按现状计算）
验收标准：
从设备有效表面积中回收的原料药（API）含量不得超过10 ppm，以确保后续批次的质量。
分析方法验证参数
用于检测拭子及冲洗样本中微量原料药（API）的分析方法需针对以下参数进行验证：
系统适用性（System Suitability）与系统精度（System Precision）
目标
为了证明并验证色谱系统的适用性参数能够满足所进行分析的需求。
程序；步骤；操作规程
按照测试程序，配制API的标准溶液（目标浓度为10 ppm）以及其他所需溶液。注射空白样品，并对标准溶液进行五次重复实验。计算这五次实验中API峰面积的RSD（相对标准偏差）。将结果记录在观察表1中。
观察结果：表1（HPLC识别码）
标准溶液（10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, %）
| |
验收标准：
标准溶液的五个重复注射中，API峰面积的相对标准偏差（RSD）不应超过2.0%。
线性与范围:
目标
为了证明该分析方法具备以下能力：
• 获取的测试结果与样品中分析物的浓度（含量）成正比。这就是所谓的“线性关系”。
• 当应用于含有分析物且其含量处于分析程序规定范围（包括范围极限）内的样品时，应提供可接受的线性度和精确度。
程序；步骤；操作规程
准备一系列标准制剂（至少五种浓度），浓度范围从（例如）标准浓度的0.1%开始。每种标准制剂分别注射三次，然后取三次测量的平均面积用于计算。通过回归函数绘制浓度与峰面积的关系图，以确定API的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。
绘制每个浓度（ppm）与平均面积之间的线性图，并确定斜率（S）。该斜率S可以通过分析物的校准曲线来估算。σ的估算也可以基于校准曲线进行。将观察结果记录在表2A和表2B中。
根据以下公式确定 LOD（检测限）和 LOQ（定量限）的浓度水平。
检测限（Limit of Detection, LOD）可以表示为：
LOD = 3.3 σ
S
定量限（LOQ）可以表示为：
LOQ = 10 σ
S
其中 σ 表示回归线的残差标准差（residual standard deviation）。
S = 校准曲线的斜率。
观察结果：表2 A（高效液相色谱法（HPLC）识别代码）
标准溶液（浓度为10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均数；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）
| |
观察结果：表2B（高效液相色谱法（HPLC）识别代码）
标准溶液
| ||
高级编号
|
浓度（ppm）
|
平均数；平均水平 原料药（API）领域
|
1
| ||
2
| ||
3
| ||
4
| ||
5
| ||
6
| ||
7
| ||
8
| ||
9
| ||
10
| ||
相关系数 ‘r’
| ||
坡度（米）
| ||
Y轴截距
| ||
验收标准：
[if !supportLists]1. 系统适用性标准必须符合分析方法的要求才能通过验证。
[if !supportLists]2. 根据线性研究结果，推导出检测限（LOD）和定量限（LOQ）的浓度值。
[if !supportLists]3. 相关系数‘r’不应小于0.995。
在检测限（LOQ）水平下的精确度:
在六个重复实验中加入LOQ（最低检测限）水平的样品，以评估在LOQ水平下的精密度。将结果记录在观察表-2C中。
观察结果：表2C（高效液相色谱法（HPLC）鉴定结果）
高级编号
|
检测限（Limit of Detection, LOQ）
|
原料药（API）领域
|
1
|
注射剂1
| |
2
|
注射剂2
| |
3
|
注射剂_3
| |
4
|
注射剂_4
| |
5
|
注射剂_5
| |
6
|
注射剂_6
| |
平均；平均水平
| ||
SD
| ||
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）
| ||
验收标准：
在LOQ（最低检测限）水平下，六次注射的相对标准偏差（RSD）不应超过10.0%。
从检测限（LOQ）到200%范围内的线性度:
程序；步骤；操作规程
为了评估线性，需要制备六种不同浓度的原料药（API）的标准溶液（浓度范围从最低检测限（LOQ）到目标浓度的200%）。每种标准溶液需注射三次。然后绘制浓度（ppm）与各浓度下平均面积的线性图。计算相关系数、斜率（m）和Y轴截距，并将观测结果记录在表2D和表2E中。
观察结果：表2D（高效液相色谱法（HPLC）识别信息）
标准溶液（浓度为10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）
| |
观察结果：表2E（高效液相色谱法（HPLC）鉴定结果）
来自标准溶液
| |||
序号
|
线性水平（%）
|
浓度（ppm）
|
平均面积
|
1
|
LOQ（Limit of Quantification，定量限）
| ||
2
|
25
| ||
3
|
50
| ||
4
|
75
| ||
5
|
100
| ||
6
|
125
| ||
7
|
150
| ||
8
|
200
| ||
相关系数 ‘r’
| |||
坡度（米）
| |||
Y轴截距
| |||
验收标准：
[if !supportLists]1. 系统适用性标准必须符合分析方法的要求才能通过验证。
[if !supportLists]2. 相关系数‘r’不应小于0.995。
准确度/回收率：
目标
为了证明该分析方法能够产生接近真实值的数据结果，具体描述如下：
• 被接受为公认的准确值。（准确性）
• 一个公认的参考值与实际测量得到的值。（回收率）
在10×10厘米的316L不锈钢板上进行回收实验。
储备溶液的制备：
标准品的制备
建立回收因子（Establishment of Recovery Factor）
在选定的溶剂中配制原料药的标准储备溶液，分别取0.5 mL、1 mL和1.5 mL，用于制备浓度为50%、100%和150%的样品。将这些样品点涂在10厘米×10厘米的316L不锈钢板上，并确保均匀分布。
让平板干燥后进行擦拭操作。将5毫升稀释液转移到一个已清洗的试管中。将一根干净的拭子放入试管中，擦拭时需通过垂直和水平的动作覆盖整个表面。在每次擦拭SS平板后，注意要小心地提起拭子。将所有收集到的拭子样本放入含有5毫升稀释液的试管中，然后进行至少10分钟的超声处理，并用稀释液将体积稀释至10毫升。测试溶液的浓度应接近目标标准品的浓度。最后对溶液进行过滤。 通过0.45微米注射过滤器过滤溶液。同样地，将拭子浸入5毫升稀释液中并超声处理10分钟，以制备对照空白样品。随后，将稀释液空白样品、对照空白样品、标准品和测试样品注入色谱系统中。
计算回收的残留物的含量（单位：ppm）。
“Where...”
AT = 面积；范围；领域 拭子样本溶液中的原料药（API）
A由于提供的内容仅为“s”这一个字符，无法进行有效的翻译。请提供更完整的文本或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译服务。 = 平均面积 标准溶液中的原料药（API）
W由于提供的文本“s”是一个字母，没有具体的含义或上下文，因此无法进行准确的翻译。请提供更多的信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 = 取用的标准品重量（毫克）
D1 = 标准品的稀释倍数
V 由于您提供的内容“f”是一个字母，没有具体的含义或上下文，我无法为您进行翻译。请提供更多信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 = 样品的最终体积
Vs = 在10x10厘米大小的琼脂平板上标准菌落的接种量（或扩散体积）。
计算回收率（% recovery）。
R
由于“p”本身不是一个常见的英文术语或短语，在制药行业的专业术语中也没有明确的对应中文翻译。如果“p”是某个特定上下文中的缩写或代码，可能需要提供更多的背景信息才能给出准确的翻译。如果“p”是指“part”（部分）、“page”（页面）或其他特定含义，请提供更多上下文以便进行准确的翻译。
= 回收的残留物含量（以百万分之一 ppm 为单位）
R由于您提供的文本 "T" 是一个字母，没有具体的含义或上下文，我无法为您翻译它。请提供更多的信息或上下文，以便我能够为您提供准确的翻译。 添加的残留物量（以百万分之一 ppm 为单位）
[RF = 回收因子（RF = API从SS平板上的回收率百分比，即100%）]
程序；步骤；操作规程
按照以下顺序注射空白溶液、对照空白溶液和标准溶液，并测定各自的回收率。将结果记录在观察表-3A和表-3B中。
详细信息；详情
|
注射次数
|
空白；空缺
|
1
|
**受控空白样本**
|
1
|
标准溶液
|
5
|
回收率水平 -1（50%）
|
3
|
回收率水平 -2（100%）
|
3
|
回收率水平 -3（150%）
|
3
|
标准溶液（括号标注）
|
1
|
观察结果：表3A（高效液相色谱法（HPLC）鉴定结果）
标准溶液（浓度为10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, %）
| |
观察结果：表3B（高效液相色谱法（HPLC）识别代码）
标准；规格；准则 溶液；配方；解决办法
| |||
序号
|
**复制；重复**
|
平板上所取的样品浓度（占目标浓度的百分比）
|
回收；恢复；复苏；挽回
(%)
|
1
|
1
|
50
| |
2
|
50
| ||
3
|
50
| ||
2
|
1
|
100
| |
2
|
100
| ||
3
|
100
| ||
3
|
1
|
150
| |
2
|
150
| ||
3
|
150
| ||
平均回收率百分比
| |||
验收标准：
[if !supportLists]1. 系统适用性标准必须按照分析方法的要求通过验证。
[if !supportLists]2. 在残留分析中，从SS平板上回收的量应在70%至130%之间。
安慰剂回收率：
目标；目的
为了证明该分析方法能够产生接近真实值的数据结果，具体描述如下：
• 被公认为一个公认的、真实的值。（准确性）
• 一个公认的参考值与实际测量得到的值。（回收率）
程序；步骤；操作规程
通过在安慰剂中添加低水平（LOQ）或50%浓度的原料药（API），来确定其准确度和回收率。
API的目标浓度分别为100%和150%（即10 ppm的50%至150%）。在安慰剂中分别添加LOQ（最低检测限）、50%、100%和150%水平的药物量。每种浓度制备三份样品并各注射一次。计算并记录API的回收率，结果记录在表4A、表4B和表4C中。
观察结果：表4A（高效液相色谱法（HPLC）识别代码）
标准溶液（浓度为10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）
| |
观察结果：表4B（高效液相色谱法（HPLC）鉴定结果）
级别；层次；水平
|
...的数量
安慰剂
|
添加的标准品用量
X
|
响应；答复；回应
|
回收量
Y
|
X2
|
XY
|
LOQ水平（Limit of Quantification）
|
--
|
--
| ||||
配方：n (SXY) - (SX) (SY)
% R = ------------------------------------ × 100
n (SX)2 - (SX)2
其中，'n' 表示实验次数，例如为 3 次。
观察结果：表4C（高效液相色谱法（HPLC）鉴定结果）
级别；层次；水平
|
...的数量
安慰剂
|
添加的标准品用量
X
|
响应；答复；回应
|
回收量
Y
|
X2
|
XY
|
50%
|
--
|
--
| ||||
含义；意思
| ||||||
100%
|
--
|
--
| ||||
含义；意思
| ||||||
150%
|
--
|
--
| ||||
含义；意思
| ||||||
SX =
|
SY =
|
SX2 =
|
SXY =
| |||
配方：n (SXY) - (SX) (SY)
% R = ------------------------------------ × 100
n (SX)2 - (SX)2
其中 ‘n’ 表示实验次数，即 9 次。
验收标准：
[if !supportLists]1. 系统适用性标准必须按照分析方法的要求通过验证。
[if !supportLists]2. 在LOQ（最低检测限）水平下，平均回收率应在80%至120%之间。
[if !supportLists]3. 从50%到150%的平均回收率应在目标浓度（理论值）的90%到110%范围内。
目标
为了确定拭子样品溶液的稳定性。
用于拭子样本的溶液
根据“Recovery on SS plate”参数中的测试程序（参见第8.0节），按照100%的浓度制备拭子样品溶液，并在0小时时进行注射。将同一溶液置于室温（22ºC ± 2ºC）下，然后在2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后分别进行注射。计算24小时内的不同时间点的回收率百分比。将观察结果记录在表-5A和表-5B中。
观察结果：表5A（高效液相色谱法（HPLC）鉴定结果）
标准溶液（浓度为10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）
| |
观察结果：表5B（高效液相色谱法（HPLC）识别代码）
拭子样本溶液
| |
时间（以小时计）
|
回收率（% Recovery）
|
初始的；开始的
| |
2
| |
4
| |
8
| |
12
| |
24
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, %）
| |
验收标准：
系统适用性标准必须符合分析方法的要求才能通过验证。
2. 原料药（API）平板回收率的相对标准偏差（RSD）为百分之…… 在24小时内的不同时间间隔内，数量不得超过5.0。
过滤器评估
目标；目的
为了证明该分析方法不受样品溶液过滤处理或离心处理的影响。
程序；步骤；操作规程
根据“安慰剂回收”参数中的测试程序，将样品制备至100%的浓度（参见第8.0节）。将样品通过0.45 µm的注射过滤器进行过滤。然后以2000转/分钟的速度离心该样品15分钟，并再次通过Whatman 1号滤纸进行过滤。将结果记录在观察表-6A和表-6B中。
观察结果：表6A（高效液相色谱法识别结果）
标准溶液（10 ppm）
| |
高级编号
|
原料药（API）领域
|
1
| |
2
| |
3
| |
4
| |
5
| |
平均；平均水平
| |
SD
| |
相对标准偏差（Relative Standard Deviation, %）
| |
观察结果：表6B（高效液相色谱法（HPLC）识别代码）
| 过滤器类型/离心机型号 |
绝对差异
| |
| 0.45微米注射器过滤器 | ||
| 离心机 | ||
| Whatman No. 1 滤纸 |
验收标准：
[if !supportLists]1. 系统适用性标准必须按照分析方法的要求通过验证。
[if !supportLists]2. “%”之间的绝对差值 回收；恢复；复苏；挽回 通过过滤得到的样品
0.45 µ 注射器过滤器过滤后的样品以及未经过滤（仅经过离心处理的）样品的浓度不应超过2.0。
[if !supportLists]3. “%”之间的绝对差异 回收；恢复；复苏；挽回 通过过滤得到的样品
Whatman No.1过滤器过滤后的样品以及未经过滤（但经过离心处理的）样品，其结果不应超过2.0。
[if !supportLists]4. 与未过滤（离心处理）的样品相比，过滤后的样品不应出现任何额外的峰。
建议与意见：
根据结果的解释和参考文件的要求，在验证报告中记录相关建议或意见。
重新验证标准：
在以下情况下，可能需要进行再验证：
- 原料药合成过程中的变化；
- 制剂成分的变化；
- 分析程序的变更。
所需的重新验证程度取决于变更的性质。
附录：
验证报告应附上附件。
参考文献：
缩写：
编号：无
|
数字；号码
|
+
|
正负；大约；上下浮动
|
即；也就是说
|
那就是；也就是说
|
RSD
RRF
%
|
相对标准偏差
相对保留因子
百分比
|
ID
WS
百万分之一（parts per million）
小时（hours）
原料药（Active Pharmaceutical Ingredient）
|
识别编号
不锈钢
工作标准；操作标准
百万分之……
小时
有效的；活跃的；起作用的 **药品成分**
|
修订历史：
高级编号
|
修订编号
|
生效日期
|
变更控制编号：
|
提交人：
迪帕克·多特（Dipak Dhote）
蓝十字实验室有限公司
A12, MIDC, Ambad, Nashik-422010
印度马哈拉施特拉邦
电子邮件：dipak.d@bluecrosslabs.com