1.0 所需设备
LAF过滤装置；过滤组件
无菌0.45微米膜过滤器
无菌移液器 – 1毫升和10毫升容量
所需材料为2.0。
无菌0.1%（重量/体积）蛋白胨溶液，3份，每份100毫升70%异丙醇溶液
用于检测的样品
SCDA 和 SCDA 板
SDA（Software Development Assistant）和SDA plates（软件开发辅助工具/板）
SCDM 3 X 100 ml
3.0 程序
3.1 总需氧菌计数
3.1.1 根据采样计划收集用于微生物限度检测的样品。3.1.2 使用各专论中规定的样品量，并按照以下方法对样品进行预处理。
3.1.3 水溶性产品：除非另有规定，否则将10克样品溶解在90毫升的无菌蛋白胨水中，或稀释10毫升样品至该体积。 缓冲的；有缓冲作用的 氯化钠-蛋白胨溶液，pH值为7.0
3.1.4 产品不溶于水：除非另有规定，将10克或10毫升样品悬浮在含有0.1%聚山梨酯80的无菌90毫升蛋白胨水中，或pH值为7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液中。
3.1.5 脂肪类产品：除非另有规定，将10克或10毫升的样品与5克聚山梨酯80混合均匀。如有必要，加热至不超过40°C。在水浴中保持温度的同时仔细搅拌。然后加入85毫升无菌蛋白胨水或pH值为7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液。
3.2 采用膜过滤法对样品进行检测
3.2.1 以无菌方式连接橡胶管。 无菌歧管 输送至接收罐，再通过接收罐的橡胶管道输送至…… 真空泵.3.2.2 使用无菌、光滑头端的镊子，放置一个直径为47毫米、长度为0.45毫米的无菌…… 膜过滤器 将漏斗放置在过滤器支架的中央。在不移动过滤器的情况下，将漏斗放在过滤器支架的底座上。
3.2.3 将步骤3.1.3中预处理好的10毫升样品分别转移到每两份90毫升的无菌0.1%蛋白胨水中。充分混合后，将全部稀释液转移到两个膜过滤器中，并立即进行过滤。
3.2.4 使用每次300毫升的无菌0.1%蛋白胨水清洗膜过滤器，并在部分真空条件下进行过滤。
3.2.5 完成后 过滤 操作流程：使用真空控制键关闭真空系统。
3.2.6 将其中一个用于细菌计数的膜过滤器转移到含有SDA的平板表面；将另一个用于真菌计数的膜过滤器转移到含有SDA的平板表面。
3.2.7 对于阳性对照，执行相同的操作程序，但需重复两次：一次使用100毫升的液体A并接种100个细菌细胞；另一次使用100毫升的液体A并接种白色念珠菌（c.albicans）。 总需氧菌和真菌计数的测定 分别；各自。
3.2.8 对于阴性对照，除了使用的样品不同（100毫升无菌0.1%蛋白胨水）外，应执行相同的程序。
5.3.2.9 将平板在30至35°C的温度下培养5天（用于细菌检测），或在20至25°C的温度下培养5天（用于真菌检测），除非能在更短的时间内获得更准确的计数结果。
3.2.10 计算形成的菌落数量。计算每克或每毫升被检测样品中的菌落形成单位（cfu）。
3.3 样品平板计数法的检测
3.3.1 该方法适用于脂肪类产品以及不溶于水的产品。3.3.2 使用90毫米的无菌培养皿。准备四个培养皿，其中两个用于细菌计数，另外两个用于真菌计数。将每个预处理后的稀释样品溶液各1毫升转移到四个培养皿中。
3.3.3 在不超过45°C的温度下，向两个标有细菌计数标签的培养皿中加入15毫升无菌的液化SCDA（SCDA为特定化学物质的缩写）。
3.3.4 然后加入15毫升无菌的液化SDA（SDA为某种特定物质，此处为假设性名称），温度控制在45°C以下，将其加入到两个标记好的培养皿中，用于检测真菌数量。
3.3.5 允许平板在室温下固化，然后倒置并在30至35°C下孵育5天，以及在20至25°C下孵育5天。
3.3.6 计算形成的菌落数量。计算每克或每毫升被检测样品中的菌落形成单位（cfu）。
3.4 检测特定微生物
3.5 膜过滤法
3.5.1 按照 3.2.1 至 3.2.5 中描述的相同步骤操作，将用于富集大肠杆菌（E. coli）和沙门氏菌（Salmonella）的膜过滤器转移到含有 100 毫升无菌营养肉汤的试管中；将用于富集铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的膜过滤器转移到含有 100 毫升无菌培养基的试管中。 大豆酪蛋白消化培养基.3.5.2 对于阳性对照，除了使用含有约100个大肠杆菌（E. coli）或沙门氏菌（Salmonella）细胞的蛋白胨水样品外，其余操作均需重复进行两次。另外100毫升蛋白胨水中需接种金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）或铜绿假单胞菌（Ps. aeruginosa），然后将膜分别转移到100毫升无菌营养肉汤培养基和大豆酪蛋白消化培养基中。
3.5.3 对于阴性对照实验，除了样品使用不同之外，其他步骤均相同：两个试管均使用100毫升的无菌蛋白胨水。
3.6 板计数法（直接接种法）
3.6.1 该方法适用于脂肪类产品以及不溶于水的制剂。3.6.2 将步骤3.1.4和3.1.5中预处理后的样品各1毫升分别转移到含有100毫升无菌营养肉汤和大豆酪蛋白消化培养基的试管中。
3.6.3 对于阳性对照实验，将大约10到100个大肠杆菌（E. coli）或沙门氏菌（salmonella）细胞接种到营养肉汤中，同时将金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）或铜绿假单胞菌（Ps. aeruginosa）接种到大豆酪蛋白消化培养基（Soybean casein digest medium）中。
3.6.4 对于阴性对照，需在培养基中接种1毫升无菌蛋白胨水。
3.6.5 将所有试管在35–37°C的温度下孵育18至24小时。
3.6.6 通过观察试管的浑浊度来判断是否有微生物生长。如果样品试管和阳性对照试管中出现生长现象，而阴性对照试管中没有生长，则需要进一步鉴定具体的微生物，例如大肠杆菌（E. coli）、沙门氏菌（Salmonella）、铜绿假单胞菌（Ps aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
3.6.7 如果样品管和阴性对照管中没有观察到生长现象，而阳性对照管中观察到生长现象，则无需进一步鉴定具体的微生物，例如大肠杆菌（E. coli）、沙门氏菌（Salmonella）、铜绿假单胞菌（Ps aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
3.7 大肠杆菌
3.7.1 使用接种环，从富集培养物（从上一次测试的营养肉汤中获得）中取一部分样本，在培养基表面进行划线接种。 **MacConkeys agar** 板；平板；盘子3.7.2 同时进行阳性对照实验：在MacConkeys琼脂平板表面划线接种大肠杆菌（E. coli）以观察其生长情况。对于阴性对照实验，则无需接种任何菌株，直接将平板置于培养箱中培养。
3.7.3 将所有平板倒置后，在35至37°C的温度下培养24小时。
3.7.4 经检查，如果所有菌落均不是砖红色，并且周围没有胆汁沉淀环，则该样品符合“无大肠杆菌”的检测要求。
3.7.5 如果发现上述描述的菌落，需将可疑菌落逐一转移至培养基表面进行进一步培养和鉴定。 Levine eosin-methylene blue agar 介质；媒介；手段
3.7.6 同时进行阳性对照实验：在MacConkeys琼脂平板表面划线接种大肠杆菌（E. coli）以观察其生长情况。对于阴性对照实验，则无需接种任何菌株，直接将平板置于培养箱中培养。
3.7.7 将所有平板倒置后，在35至37°C的温度下培养24小时。
3.7.8 经检查，如果没有任何菌落在进行反射光观察时显示出特有的金属光泽，则该样品符合“无大肠杆菌”的检测要求。
3.8 沙门氏菌
3.8.1 主要试验：将1.0毫升富集培养液（从上一次试验的营养肉汤中获得）无菌加入到两个试管中，每个试管分别含有10毫升无菌的Selenite F肉汤和四硫代硫酸盐-胆汁-亮绿肉汤，然后在35至37°C下培养24至48小时。3.8.2 从这两种培养物中各取一份样本。 **子培养** 在以下四种琼脂培养基中的至少两种上进行培养：亚硫酸铋琼脂、亮绿琼脂、脱氧胆酸盐-柠檬酸琼脂和木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐琼脂。
3.8.3 同时进行阳性对照实验：在用于测试的培养基表面划线接种一环生长完全的沙门氏菌（Salmonella）；对于阴性对照实验，则无需划线接种，直接将琼脂平板放入培养箱中培养。
3.8.4 将所有平板倒置后，在35至37°C的温度下培养18至24小时。
3.8.5 经检查，如果没有任何菌落符合表1中的描述，则该样品符合“无沙门氏菌属存在”的测试要求。
3.8.6 如果发现任何符合表1描述的菌落，应进行二次测试。
表1
“Sr. No.” 可以翻译为“高级编号”或“资深编号”。这个术语通常用于表示在某个系统、列表或文件中具有较高优先级或级别的编号。例如，在药品生产质量管理规范（GMP）的文件体系中，可能会使用“Sr. No.”来标识重要的或优先级的条款或文件。
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中等；中度
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菌落描述
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1
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亚硫酸铋琼脂
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黑色或绿色
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2
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亮绿琼脂
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体积小、透明或无色，也可能呈不透明状，颜色为粉红色或白色（通常周围有一圈粉红色或红色的区域）。
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3
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脱氧胆酸盐-柠檬酸盐琼脂
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无色且不透明，中心可能为黑色，也可能不是黑色。
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4
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木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐琼脂
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红色，中心可能带有黑色或没有黑色。
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3.8.8 同时接种一支尿素肉汤试管。在36至38°C的温度下培养18至24小时。
3.8.9 经检查，未发现试管出现碱性（红色）斜面或酸性（黄色）底部的现象（无论是否伴有因产生硫化氢而导致的底部变黑），因此该样品符合“无沙门氏菌属存在”的测试要求。
3.9 绿脓假单胞菌
3.9.1 从大豆酪蛋白消化培养基（取自上次测试的营养肉汤）中取一部分培养物，将其划线接种到十六烷基三甲基溴化铵（Cetrimide）琼脂培养基的表面上。3.9.2 同时进行阳性对照实验：在头孢米啶琼脂表面划线接种一环生长良好的铜绿假单胞菌（Ps. aeruginosa）。对于阴性对照实验，将头孢米啶琼脂平板无需接种直接进行培养。将所有平板倒置后，置于35至37°C的温度下培养18至24小时。
3.9.3 如果经检查，所有培养皿中均未出现具有表2中所列特征的菌落（针对所使用的培养基而言），则该样品符合无铜绿假单胞菌（Ps. aeruginosa）污染的要求。
3.9.4 如果培养出任何符合表格描述的菌落（数量为3个），则需要进行氧化酶和色素测试。
表2
中等；中度
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菌落特征
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紫外光下的荧光
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氧化酶
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革兰氏染色
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**Cetrimide Agar**
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通常呈绿色调。
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略带绿色的
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阳性；合格的；肯定的
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阴性菌条
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用于检测荧光素的假单胞菌琼脂培养基
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通常为无色至淡黄色。
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黄色的
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阳性；合格的；积极的
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阴性菌条
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用于检测绿脓菌（Pyocyanin）的假单胞菌琼脂培养基
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通常呈绿色调。
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蓝色
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**阳性**
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阴性菌条。
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3.9.5 颜料检测：从含有 cetrimide 的琼脂平板上选取典型的可疑菌落，将其划线接种到含有铜绿假单胞菌的琼脂培养基上，以检测荧光素的存在；同时，将相同的菌落接种到含有绿脓假单胞菌的琼脂培养基上，以检测绿脓假单胞菌色素（pyocyanin）的存在。
3.9.6 将接种后的平板盖好并翻转，然后在33至37°C的温度下培养不少于3天。3.9.7 检查条纹区域下的表面积 紫外线（UV light） 并确定这些菌落是否符合表2中的描述。
3.9.8 氧化酶试验：如果出现可疑菌落的生长，将2-3滴 freshly prepared的1% w/v N,N,N1,N1-四甲基-4-苯二胺二盐酸盐溶液滴在滤纸上，并用可疑菌落涂抹。如果没有出现粉红色或变为紫色的现象，则该样品符合无铜绿假单胞菌的要求。
3.10 金黄色葡萄球菌
3.10.1 从上一次实验的营养肉汤中取出部分大豆酪蛋白消化培养基（soybean casein digest medium），将其涂布在表3中列出的琼脂培养基（agar medium）之一表面。3.10.2 同时进行阳性对照实验：在琼脂培养基表面划线接种一环金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），使其生长。对于阴性对照实验，则无需接种细菌，直接将琼脂平板放入培养箱中培养。
3.10.3 将所有平板倒置后，在35至37°C的温度下培养18至24小时。
3.10.4 如果经检查，所有培养皿中均未出现具有表3所列特征的菌落（针对所使用的培养基），则该样品符合无金黄色葡萄球菌的要求。
3.10.5 如果培养出3个符合表格描述的菌落，应进行凝固酶测试。
表3
“Sr. No.” 可以翻译为“高级编号”或“资深编号”。这个术语通常用于表示在某个系统、列表或文件中具有较高优先级或级别的编号。例如，在药品生产质量管理规范（GMP）的文件体系中，可能会使用“Sr. No.”来标识重要的或优先级较高的条款或文件。
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选择性培养基
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菌落特征
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革兰氏染色
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1
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沃格尔-约翰逊琼脂（Vogel-Johnson agar）
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被黄色区域包围的黑色部分
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成簇的阳性球菌
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2
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甘露醇盐琼脂
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黄色菌落，周围有黄色圈带
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成簇的阳性球菌
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3
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贝尔德-帕克琼脂（Baird-Parker agar）
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黑色、有光泽，周围有一圈2到5毫米宽的透明区域。
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成簇的阳性球菌
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3.10.7 在37°C下孵育，并在3小时后以及之后每隔适当的时间间隔（最长至24小时）检查试管。
3.10.8 如果未观察到任何程度的凝固现象，则该样品符合“无金黄色葡萄球菌”的检测要求。
4.0 注意事项
4.1 在整个操作过程中，必须保持双手清洁，并始终佩戴用纯异丙醇（IPA）冲洗过的手套。4.2 在每次测试中，同时进行阳性对照和阴性对照实验。
4.3 必须进行微生物限度检测。 在层流条件下（under LAF）.
4.4 对于倾注平板法，如有必要，可将样品在样品溶液中稀释，以获得100至300个菌落形成单位（cfu）。
5.0 频率
按批次6.0 缩写
标准操作规程（SOP）IPA：异丙醇
LAF：层流空气
cfu：菌落形成单位
SCDA：大豆酪蛋白消化琼脂
SCDM：大豆酪蛋白消化培养基
SDA：沙氏葡萄糖琼脂