凝胶凝集法检测细菌内毒素

凝胶凝固法

方法A与方法B均依赖于将含有细菌内毒素的溶液与裂解液混合后进行培养时形成稳定凝胶这一现象。方法A属于限度检测，要求待测样品的重复制备液中的内毒素浓度均低于各相关药典规定的内毒素限度浓度。方法B则用于半定量测定待测样品中的内毒素浓度。

裂解液的灵敏度

在将每批新的裂解液用于检测之前，需使用该批次的至少一管样品来确认其标示的灵敏度。制备一系列CSE稀释液，使其浓度分别为2λ、λ、0.5λ和0.25λ，其中λ为该裂解液每毫升的标示灵敏度（单位为EU）。按照方法要求，对这四种标准浓度分别进行两次重复检测，并设置以BET水为溶剂的阴性对照。每个稀释系列中的最终稀释液至少应呈现阴性结果。

计算每组阳性稀释系列中最低细菌内毒素浓度对数的平均值。几何平均终点浓度即为裂解液在ED/ml单位下的实测灵敏度，其计算公式如下：

几何平均终点浓度 = 反对数（∑e/f）
其中，∑e为所使用的一系列稀释液的对数终点浓度之和。
f = 重复试验试管的数量。
该平均值可得出裂解液灵敏度的估算值，该数值应介于0.5λ与2λ之间。
相关内容：细菌内毒素检查（BET或LAL试验）的验证

干扰因素检测

应当牢记某些因素可能对细菌内毒素检测造成干扰。为确保检测结果的可靠性，必须证明检测样品不会抑制或增强反应，亦不会以其他方式干扰检测过程。验证若裂解液供应商、生产方法或样品配方发生变更，则必须重新进行该操作。
用去离子水稀释待测样品是克服抑制效应最简单的方法。

允许的稀释程度或最大有效稀释度（MVD）取决于制剂的浓度、该制剂所规定的细菌内毒素限度以及…… 裂解物灵敏度。其计算公式如下：

MVD = 细菌内毒素限度 × 测试溶液浓度

λ
试验溶液的制备。按照表格要求配制A至D组溶液的重复样品。

溶液A = 在等于或低于最低验证稀释度的稀释度下制备的制剂溶液（测试溶液）。
溶液B = 加入了规定浓度CSE的检测溶液（阳性产品对照品；PPC）。
溶液C = 溶于BET水中的、含有规定CSE浓度的标准溶液。
溶液D = BET水（阴性对照品；NC）。

方法

在试管、小瓶或微量滴定板孔等容器中执行以下操作：向所选用的每个容器中加入适当体积的阴性对照品（NC）、水中的标准CSE溶液、待测溶液以及阳性产品对照品（PPC）。除非使用单独的检测小瓶，否则需在能够读取各检测结果的间隔时间点，向每个容器中加入等体积的相应配制的裂解液。轻轻混合样品与裂解液的混合物，将其置于水浴锅或加热块等培养装置中，并准确记录放置的时间。将每个容器在37°±10℃下保持静止状态培养60±2分钟。取出容器后仔细观察其内容物，若出现坚固的凝胶且能通过一次平滑的180°翻转仍保持完整，则表明存在阳性反应。

将此结果记录为阳性（+）。阴性结果表现为无此类凝胶生成，或生成的凝胶粘度过高且无法保持结构完整。此类结果应记录为阴性（-）。处理容器时需格外小心，避免产生不必要的振动，否则可能导致假阴性结果。

根据裂解液灵敏度部分所述的公式，计算C系列溶液的几何平均终点浓度。

结果的计算与解读

若干扰因素检测方法具备有效性，则
(a) A系列和D系列的溶液检测结果为阴性。
(b) C系列溶液测试所得结果证实了该裂解液的标示灵敏度。
(c) B系列溶液的终点浓度几何平均值不得大于21，且不得小于0.51。

若检测结果超出规定范围，说明所检测的样品具有抑制剂或激活剂作用。可通过进一步稀释（稀释倍数不得大于MVD）、过滤、中和、灭活或去除干扰物质来消除这些干扰因素。使用灵敏度更高的裂解液可允许对所检测样品进行更大倍数的稀释。当干扰因子能通过分子量在10,000至20,000之间的过滤器时，可根据需要采用超滤处理，例如非对称过滤器。膜过滤器三醋酸纤维素的。

应检查此类过滤器是否存在导致假阳性结果的各类因素。附着在过滤器上且含有细菌内毒素的残留物，需用BET水或三氯化物溶液进行冲洗。缓冲液pH值7.4 BET法。细菌内毒素被回收至BET水或缓冲液中。需针对每份待检测样品测定测试体积与最终体积中的细菌内毒素浓度。

通过使用已添加CSE并经过选定处理后的待检测样品，再次开展干扰因素试验，以确认该处理方法能够有效消除干扰且不会导致细菌内毒素残留。
另请参阅：
方法A：凝胶凝固限度试验法
方法B：半定量凝胶凝固法