微生物检测的标准操作规程（SOP）

5.0 程序/步骤

5.1 需要采取的预防措施

5.1.1 所使用的玻璃器皿/杯孔钻必须进行灭菌处理。
5.1.2 接种时，熔融琼脂的温度应在45至50°C之间。
5.1.3 所有设备在每次使用前后都必须进行彻底清洁。
5.1.4 对于检测用圆筒（assay cylinders），应使用…… 不锈钢 或者使用以下尺寸的瓷制圆筒，每个尺寸的公差为±0.1毫米：外径8毫米；内径6毫米；长度10毫米。

5.2 测试程序

5.2.1 按照标准操作规程（SOP）准备用于检测的培养基。
5.2.2 磷酸盐缓冲液的制备。
5.2.2.1 准备 磷酸钾缓冲液 对于所检测的抗生素来说，这是必需的。这些缓冲液在制备完成后会进行灭菌处理，每种情况下规定的 pH 值都是灭菌处理后的 pH 值。 灭菌.
5.2.2.2 磷酸钾缓冲液（浓度0.1 mol/L，pH值7.0）：将13.6克二碱式磷酸钾和5.0克一碱式磷酸钾溶解在1000毫升水中，然后用18 N磷酸或10 N氢氧化钾调节pH值至7.0 ± 0.2。

5.3 标准的制定

为了制备储备溶液，将准确称量的特定抗生素的 USP 参考标准品/工作标准品，或适当情况下使用整支 USP 参考标准品小瓶的内容物，溶解在该表格中指定的溶剂中，然后按照指示稀释至所需的浓度。将制备好的溶液储存于…… 冰箱 按照指定的时间范围内使用。在检测当天，从储备溶液中制备五种或更多种测试稀释液，这些稀释液的浓度逐步增加，通常采用1:1.25的比例（用于圆筒-平板检测法）。使用规定的最终稀释剂，并按照一定的顺序进行制备，使得中间或中位数的稀释液具有指定的浓度。

5.4 样品的制备

根据待检测制剂的现有信息（即“未知样品”），为其假设一个单位重量或体积的效价。在检测当天，按照规定制备储备溶液和测试稀释液，其中每种抗生素的稀释液应使用与USP参考标准相同的最终稀释剂。对于需要五个浓度水平的标准品检测，只需使用一个浓度水平的“未知样品”，其浓度应假设为标准品的中位浓度。

5.5 接种液的制备

5.5.1 用3毫升的无菌蛋白胨盐水和无菌玻璃珠，清除最近培养的该微生物菌株中的生长物。
5.5.2 在Roux瓶的平底部分，将250毫升的大豆消化琼脂培养基表面接种微生物。
5.5.3 使用无菌玻璃珠将悬浮液均匀地涂抹在琼脂表面，然后在上述温度下进行培养。培养完成后，通过收集琼脂表面的生长物，用50毫升培养基稀释成储备悬浮液。
5.5.4 确定一个稀释因子，使得在大约530纳米波长下光透过率达到25%。
5.5.5 对于圆筒-平板法（cylinder-plate assay），通过试验确定应加入储备悬浮液（stock suspension）的比例。 **接种物；菌种**根据所指示的体积进行操作，这样可以清晰地划分出抑菌区，并获得可重复的剂量关系。制备接种液的方法是：将一定量的储备悬浮液加入到已经熔化并冷却至45至50摄氏度的琼脂培养基中，然后搅拌均匀，使其成为均匀的悬浮液。

5.6 程序

5.6.1 在圆筒-平板法（cylinder-plate assay）中，主要的比较仅限于同一平板内不同菌圈直径之间的差异，而不包括不同平板在制备和后续处理过程中的差异。
5.6.2 圆柱板法
将上述制备好的约1毫升接种物加入培养基35中，然后将培养基倒入无菌培养皿中，让其凝固。
5.6.3 两级因子实验设计（Two-level factorial assay）。
5.6.3.1 在四个平板上分别制备含有两种标准品（S1和S2）以及两种未知样品（U1和U2）的平行稀释液。将四种不同的测试稀释液依次填充到每个平板的四个孔中，确保标准品和未知样品交替排列。
5.6.3.2 将培养皿直立放置在30-35°C的温度下培养24至48小时。
5.6.3.3 将平板置于室温下保持直立状态，然后测量抑菌圈的直径。
5.6.4 效力的估算
将每种稀释度下各区域的直径相加，然后根据以下公式计算样品的效价百分比（以标准品为参考）：
% 效力 = Antilog (2.0 + a log I)
其中，某个变量（a）可以取正值或负值，并且应该以代数方式使用。
其中 a = (U1+U2) - (S1+S2)
                  (U1+U2) + (S1-S2)
U1 和 U2 分别是含有高浓度和低浓度未知物质的溶液时，各区域直径的总和。
S1和S2分别是高浓度和低浓度标准溶液对应的区域直径之和。
“I”是指稀释的比例。
5.6.5 限制：按照相应的产品规格要求。
5.6.6 样品的效力可以通过以下公式计算得出：
%效力 × 样品的假定效力
                            100

6.0 缩写词

6.1 标准操作规程（Standard Operating Procedure）
6.2 °C – 摄氏度
6.3 M – 道德
6.4 G – 克
6.5 毫升
6.6 U – 单位
6.7 ATCC – 美国典型培养物保藏中心（American Type of Culture Collection）
6.8% – 百分比