洁净室与控制区（无菌区域分类）

洁净室及其他受控环境的微生物评估

本章的目的是回顾与散装原料药、制剂以及在某些情况下与医疗器械的无菌生产相关的各种问题；同时探讨受控环境中微生物质量的建立、维护和控制方法。

本章内容包括以下内容的讨论： (1) 根据颗粒计数限值对洁净室的分类； (2) 受控环境的微生物评估程序； (3) 人员的培训； (4) 微生物评估程序设计与实施中的关键因素； (5) 采样计划的制定； (6) 微生物警戒和行动水平的设定； (7) 用于微生物采样的方法与仪器； (8) 所使用的培养基和稀释剂； (9) 微生物分离株的鉴定； (10) 通过培养基填充进行的操作评估； (11) 术语表。本章不涉及持证药店为家庭使用准备无菌产品所使用的受控环境的相关内容，这些内容在其他章节中有详细说明。药品配制——无菌制剂.

有多种方法可以用来评估和控制无菌生产环境中微生物的状态。本章中提到的数值并不代表绝对值或规格要求，仅用于提供参考信息。由于微生物采样设备和方法的多样性，不能简单地认为达到这些数值就意味着能够保证所需的微生物控制水平；同样，即使数值超出这些范围，也不一定意味着控制失效。如果微生物采样和分析方法应用不当，可能会导致结果出现较大偏差，并可能带来意想不到的问题。污染；杂质本章中提到的采样介质、设备以及采样方法并非强制性规范，仅作为参考信息提供。

大部分无菌产品是通过无菌生产工艺制造的。由于无菌生产工艺要求在整个生产过程中彻底排除微生物，并在灌装过程中防止微生物进入开放容器，因此这些产品的微生物负荷（包括细菌和内毒素等）都得到了有效控制。环境这些因素对于确保这些产品的无菌水平至关重要。

洁净室等级的划分与确定

洁净室及受控环境的设计与建造在联邦标准209E中有详细规定。该标准根据空气中颗粒物的绝对浓度来定义空气的洁净度等级。用于确定受控环境空气等级的方法，以及相关检测手段，都在该标准中有所规定。监控；监测该联邦文件仅适用于受控环境中的空气中的颗粒物。环境并且不用于判断这些颗粒是具有生命活性还是无生命活性的。

制药行业中，制造商们采用联邦标准209E来规范洁净室及其他受控环境的建设、调试和维护工作。然而，目前制药行业的数据并未提供关于非活性颗粒数量与活性微生物浓度之间关系的科学依据或共识。

在电子行业中，不可存活颗粒的数量具有极高的重要性，因此必须执行联邦标准209E。而制药行业则更关注可存活颗粒（即微生物）的数量，而非联邦标准209E所规定的总颗粒数量。在制药行业，对于注射剂产品中的总颗粒数量也确实存在一定的关注（参见……）。注射液中的颗粒物).

“洁净室中的颗粒物越少，空气中微生物的存在可能性就越低”这一观点是被广泛接受的。这一原理为制药制造商以及洁净室和其他受控环境的建设者提供了工程设计标准，帮助他们建立能够正常运行的设施。

联邦标准209E在制药行业的应用中，规定了所有粒径等于或大于0.5微米的颗粒的限量。表1 该术语描述了联邦标准209E中规定的空气悬浮颗粒物洁净等级，并将其适用于制药行业。制药行业通常要求达到M3.5级及以上的洁净度标准。M1级和M3级洁净度等级则主要适用于电子行业。表1 为了便于比较，普遍认为如果操作洁净室或其他受控环境中的颗粒物数量较少，那么该环境的洁净度就更高。环境在操作条件下，只要气流、温度和湿度没有变化，微生物计数将会更低。洁净室是根据动态数据（操作数据）进行操作控制的。

表1. 空气中颗粒物的洁净等级^*

班级名称	粒径等于或大于0.5微米的颗粒
SI	美国习惯性的；惯例的；通常的	由于您提供的文本“(m)”是一个未完成的句子或占位符，我无法为其生成准确的中文翻译。请提供完整的句子或术语，以便我能够为您提供准确的翻译服务。3 )	英尺（foot）3 )
M1	—	10.0	0.283
M1.5	1	35.3	1.00
M2	—	100	2.8
M2.5	10	353	10.0
M3	—	1,000	28.3
M3.5	100	3,530	100
M4	—	10,000	283
M4.5	1,000	35,300	1,000
M5	—	100,000	2,830
M5.5	10,000	353,000	10,000
M6		1,000,000	28,300
M6.5	100,000	3,530,000	100,000
M7	—	10,000,000	283,000
* 改编自美国联邦标准209E，1992年9月11日——“洁净室和洁净区内的空气悬浮颗粒物洁净等级”。

受控环境微生物评估计划的重要性

监控；监测在受控环境中，即使持续使用电子仪器进行颗粒计数，也无法提供关于微生物含量的信息。环境颗粒计数器的基本局限性在于它们只能测量直径为0.5微米或更大的颗粒。虽然空气中的微生物不是自由漂浮的单独细胞，但它们通常会附着在直径为10到20微米的颗粒上。在受控环境中，颗粒计数和微生物计数会随着采样位置以及采样时进行的操作而发生变化。监控；监测 the 环境对于非活性颗粒物和微生物的控制是非常重要的，因为这两者都是实现药品符合药典要求的关键因素。颗粒物以及无菌状态；无菌性在...的指导下；按照...的要求注射液 á1ñ .

微生物的监控；监测用于控制环境的程序应评估清洁和消毒措施的有效性，以及可能影响该环境中微生物负荷（bioburden）的人员行为。环境微生物的监控；监测无论系统多么先进，它都无法也不需要识别和量化这些受控环境中存在的所有微生物污染物。然而，常规的微生物检测方法仍然可以提供有用的信息。监控；监测应提供足够的信息，以确保能够确认该受控项目符合相关要求。环境处于受控状态之下；运行正常且符合相关标准。

环境微生物监控；监测由合格人员进行的数据收集和分析将确保洁净室及其他受控环境中的控制状态得以维持。环境在正常操作过程中应进行采样，以便收集有意义的数据。当材料位于指定区域、加工活动正在进行中，并且所有操作人员都在现场时，应进行微生物采样。

微生物的监控；监测在洁净室及其他受控环境中（如适用），应定期对室内空气、进入关键区域的压缩空气、各种表面、设备、消毒容器、地板和墙壁的微生物含量进行定量检测。人员防护服（例如：工作服和手套）。微生物控制的目的是…… 监控；监测该计划的目的是获得制剂中微生物负荷的代表性估计值。环境在数据整理和分析过程中，任何异常趋势都应由受过培训的人员进行评估。虽然按照推荐和规定的频率审查环境监测结果非常重要，但长期跟踪这些结果以判断是否存在趋势同样关键。通过构建包含警戒限和行动限的统计控制图，可以直观地识别出这些趋势。受控环境中的微生物控制情况也可以通过这些趋势数据来评估。应定期发布报告或总结，以提醒相关负责人。

当受控环境中规定的微生物水平超出允许范围时…… 环境如果某个关键质量属性（CQA）或关键工艺参数（CPP）的监测结果超出规定范围（Out-of-Specification, OOS），应进行文件审查和调查。调查的具体细节可能因生产该产品的房间类型和加工过程而有所不同。调查应包括对区域维护记录、消毒记录的审查，以及环境温度等固有物理或操作参数的变化情况。相对湿度以及相关人员的培训情况。根据调查结果，采取的措施可能包括加强对人员的培训，以强调微生物控制的重要性。环境增加采样频率；加强消毒措施；对产品进行额外检测；确定微生物污染物的种类及其可能的来源；并评估是否需要重新评估现有的标准操作规程，必要时进行重新验证。

根据对调查和测试结果的审查，可以确定微生物水平超标的情况的严重性，以及在该条件下进行的操作或生产出的产品的可接受性。所有的调查过程及其采取的行动依据都应当被记录下来，并作为整个质量管理体系的一部分。

受控的环境例如，洁净区或洁净室的定义是根据相关的洁净室操作标准进行认证的。评估的参数包括过滤器完整性、空气流速、空气流动模式等。换气次数...以及压力差这些参数可能会影响洁净室操作中的微生物负荷（即洁净室内的微生物数量）。洁净室的设计、建造和运行方式差异很大，因此很难对这些参数制定统一的标准。Ljungquist 和 Reinmuller 提出了一种通过增加关键工作区域和设备附近的环境颗粒浓度来进行颗粒挑战测试的方法。首先，利用烟雾生成技术可以直观地观察整个洁净室或受控环境中的空气流动情况。环境可以观察到涡流或湍流区域的存在，可以通过调整气流模式来消除或减少这些不良影响。随后，在接近关键区域的部位会产生颗粒物。无菌环境；无菌区域这项评估是在模拟生产条件下进行的，但使用了实际的生产设备和人员。

对洁净室或受控环境的物理特性进行适当的测试和优化。环境在完成微生物学验证之前，这是必不可少的。监控；监测 **程序。确保受控的……得到保障。** 环境如果设备运行正常且符合其工程规格要求，那么就能更有效地确保产品的微生物负荷（bioburden）处于可控范围内。环境这些测试适用于无菌生产工艺。在洁净室或控制环境的常规认证过程中，应重复进行这些测试。环境并且每当对操作流程（如人员流动、加工方式、操作步骤、物料传输、空气处理系统或设备布局）进行更改时，如果这些更改被认定为会对产品质量或生产过程产生显著影响，就必须采取相应的措施。

人员培训

对于采用无菌生产工艺制造的产品，制造商必须密切关注细节，并对相关人员实施严格的纪律管理和监督，以确保最终产品的无菌状态达到所需的环境质量标准。

在受控环境中工作的所有人员的培训都至关重要。对于那些负责微生物控制的人员来说，这种培训同样重要。监控；监测在某些程序中，可能在微生物采样过程中无意间导致洁净工作区受到污染。在高度自动化的操作环境中，这种情况尤为常见。监控；监测人员可能是那些与生产区域内关键区域有最直接接触的员工。监控；监测在人员进入或离开处理区域之前，必须进行相应的卫生程序（如洗手、更衣等）。

微生物采样如果采用不当的技术，可能会导致微生物污染。因此，必须实施正式的人员培训计划以降低这种风险。所有进入控制区域的人员都应接受这种正式培训，并且培训内容应当被记录在案。

设施的管理必须确保所有在洁净室和受控环境中工作的人员都熟悉相关的微生物学原理。培训内容应包括无菌生产的基本原则，以及制造和处理程序与产品污染潜在来源之间的关系。此外，培训还应涵盖微生物学基础、微生物生理学、消毒方法等方面的知识。卫生；清洁；消毒根据参与无菌生产工艺人员的职责要求，必须进行适当的媒介选择与准备、分类以及灭菌处理。负责微生物鉴定的人员需要接受相关实验室方法的专门培训。同时，所有相关人员还必须接受关于如何管理收集到的环境数据的额外培训。掌握并理解适用的标准操作规程至关重要，尤其是那些与环境条件变化时需要采取的纠正措施相关的标准操作规程。培训内容应包括对法规合规性的理解，以及每个人在药品生产质量管理规范（GMP）方面的职责；此外，还必须包括进行调查和分析数据的技能培训。

受控环境中微生物污染的主要来源是人员。污染可能由个人传播微生物引起，尤其是那些患有活动性感染的人。只有健康的人员才被允许进入受控环境。

这些事实凸显了良好的个人卫生习惯以及在进入控制区的员工所遵循的无菌穿衣程序中细致入微的注意力的重要性。环境一旦这些员工穿戴好个人防护装备（包括完全覆盖面部的防护服），他们就必须时刻注意保持手套和防护服的完整性。由于无菌生产过程中产品污染的主要威胁来自操作人员，因此控制与这些人员相关的微生物污染是环境控制计划中最重要的环节之一。

对在受控环境中工作的人员进行全面培训的重要性，包括无菌技术方面的培训，再怎么强调也不为过。这些人员需要严格遵守环境控制要求，以确保生产过程的安全性和产品的质量。监控；监测仅凭该程序本身，无法检测到无菌生产过程中所有可能影响制剂微生物质量的事件。环境因此，定期进行介质填充或工艺模拟研究以重新验证工艺是必要的，以确保适当的操作控制和培训得到有效维护。

设计和实施微生物环境控制计划所涉及的关键因素

环境控制程序应当能够及时检测到微生物条件的不利变化，从而采取有意义且有效的纠正措施。制造商有责任制定、启动、执行并记录此类微生物环境控制程序。监控；监测程序；计划；项目

虽然会讨论环境控制计划的一般性建议，但至关重要的是，该计划必须根据具体设施和条件进行定制。在大多数情况下，像大豆酪蛋白消化培养基（Soybean Casein Digest Medium）这样的通用微生物生长培养基应该是合适的。这种培养基可以添加一些添加剂，以克服或减少消毒剂的影响，或者在这些环境中使用或处理抗生素时减少其影响。应当考虑对酵母和霉菌的检测和定量。像沙氏培养基（Sabouraud's Medium）、改良沙氏培养基（Modified Sabouraud's Medium）或抑制性霉菌琼脂（Inhibitory Mold Agar）这样的通用真菌培养基也是可以接受的。其他经过验证、能够促进真菌生长的培养基（如大豆酪蛋白消化琼脂）也可以使用。通常情况下，不会常规性地检测强制厌氧菌。然而，如果条件或调查需要（例如在无菌检查设施中识别这些微生物），则应进行更频繁的检测。应评估所选培养基检测和定量这些厌氧菌或微需氧微生物的能力。

在选择了合适的培养基之后，接下来会确定培养和孵化的温度。通常，孵化的温度设定在 22.5 ± 2.5℃ 的范围内。 32.5 ± 2.5 分别使用了72小时和48小时的培养时间。用于环境监测计划中制备培养基的灭菌过程需要进行验证；此外，还应按照规定对培养基进行无菌性和促生长能力的检测。无菌检查此外，对于…… 生长促进从受控环境中分离出的代表性微生物群落进行检测。环境或者可以使用这些分离株的 ATCC（美国典型培养物保藏中心）菌株制备物来测试培养基。当接种的挑战微生物少于 100 个菌落形成单位（cfu）时，培养基必须能够支持其生长。

适当的环境控制计划应包括对采样点的识别与评估，以及对微生物采样方法的验证。环境.

用于鉴定分离株的方法应使用指示性微生物进行验证（参见……）微生物限度检测 ).

制定取样计划和取样点

在洁净室或其他受控环境的初次启动或调试过程中，环境应确定空气和表面采样的具体位置。需要考虑这些位置与产品的距离，以及空气和表面是否可能接触到产品或容器密封系统的敏感部位。这些区域应被视为关键区域，需要采取更严格的控制措施。监控；监测比非产品接触区域更严格。在…… **parenteral** **释义：** “Parenteral” 是一个医学术语，指通过非肠道途径（如静脉注射、肌肉注射等）给药的方式。与“oral”（口服）相对，这类药物通常不能被胃肠道吸收，因此需要直接注入血液循环系统。 **应用场景：** 常用于描述需要快速生效或不能通过口腔摄入的药物，例如抗生素、激素、疫苗等。 **示例：** - “The patient received a parenteral injection to treat the infection.”（患者接受了静脉注射以治疗感染。） - “Parenteral drugs require special storage conditions to maintain their efficacy.”（肠外药物需要特殊的储存条件以保持效力。）小瓶灌装操作中，操作区域通常包括容器密封材料供应区、已打开容器的存放路径，以及工作人员日常接触的其他无生命物体（例如污染物）。

采样的频率将取决于特定检测点的关键性，以及产品经过无菌处理后所接受的后处理方式。表2 显示了按照采样频率的降序排列的采样建议频率，同时考虑了被控制区域的关键性。环境正在取样中。

表2：根据控制项的严重程度建议的采样频率环境

取样区域	“Frequency of” 的中文翻译是“频率”。取样
100级或更高级别的洁净室等级	每个班次
直接翻译： “Immediately adjacent supporting areas” 解释： “Immediately adjacent supporting areas”指的是与某个特定区域（如生产车间、实验室或储存区）直接相邻的其他区域，这些区域在功能上可能为其提供支持或辅助服务（如设备维护、物料储存、废物处理等）。在制药或医疗行业中，这种布局有助于确保生产流程的连续性和安全性。例如，设备维修区必须与生产区紧密相邻，以便在设备出现故障时能够迅速进行维修，避免生产中断。达到100级洁净度标准（例如10,000级）	每个班次
其他支持区域（10万级洁净室）	每周两次
潜在的产品/容器接触区域	每周两次
其他无菌生产相关的支持领域处理区域，但非产品相关内容。洁净度等级（100,000级或更低）	每周一次

随着操作过程中人工干预的增加，以及人员与产品接触的可能性增大，环境因素的相对重要性也随之提高。监控；监测项目增加了。环境方面的…… 监控；监测对于采用无菌生产工艺制造的产品而言，这一点比对于那些经过加工后再进行最终灭菌处理的产品更为关键。确定并量化那些能够抵抗后续灭菌处理的微生物，比检测产品中的微生物污染情况本身更为重要。监控；监测在制造环境中，如果终端灭菌周期不是基于“过度灭菌”的原则，而是基于灭菌前的微生物负荷（bioburden）来确定的，那么微生物负荷监测程序（bioburden program）的价值就显得至关重要。

采样计划应当具有灵活性，能够根据实际情况进行调整。监控；监测根据生产数据的趋势，调整了采样频率和样本计划的位置。根据这些数据的表现，增加或减少采样量是合适的。

在受控环境中建立微生物警戒水平和行动水平

统计过程控制（Statistical Process Control, SPC）的原理和概念在设定警戒（Alert）和行动（Action）水平以及应对生产过程中的趋势变化时非常有用。

An 警戒级别在微生物环境中监控；监测这种微生物水平表明可能存在偏离正常操作条件的情况。虽然超过警戒水平并不一定需要立即采取纠正措施，但至少应该启动一份书面记录在案的后续调查，调查内容可能包括对采样计划的调整。

An 行动级别在微生物环境方面监控；监测当微生物的数量超过规定水平时，需要立即采取后续措施；如有必要，还需执行纠正与预防措施（CAPA）。

警戒级别这些通常基于从特定受控过程中常规操作中获得的历史信息。环境.

在新设施中，这些标准通常是基于类似设施和工艺的先前经验来设定的；并且需要至少几周的微生物环境水平数据进行分析，以确定一个基准值。

这些标准通常会按照既定的频率重新评估其适用性。当历史数据表明环境条件有所改善时，可以重新评估这些标准并进行相应的调整。如果发现环境质量出现恶化趋势，就需要查明原因并制定纠正措施，以使环境条件恢复到预期范围内。同时，必须进行调查，并评估这种变化可能对产品产生的影响。

受控环境中的微生物考虑因素及行动水平

洁净室及其他受控环境的分类依据是联邦标准209E，该标准根据这些环境中的总颗粒数来划分等级。制药和医疗器械行业普遍采用了100级、10,000级和100,000级的分类标准，尤其是在设施的建筑规范方面。

尽管209E控制项与...之间没有直接的关系，但... 环境多年来，制药行业一直使用与这些等级相对应的微生物水平来评估是否符合GMP标准；这些水平已被证明可以通过现有的控制环境技术轻松达到。有报道称，使用不同的采样系统、培养基的变异性以及不同的培养温度会导致所得数值出现差异。应当认识到，虽然没有一种系统是绝对可靠的，但这些方法仍有助于检测环境质量的变化及趋势。文中显示的数值…… 表3, 4...以及 5 这些数据代表单个测试结果，仅作为参考指南提供。每个制造商的数据都应作为整体评估的一部分进行考量。监控；监测程序；计划；项目

表3. 控制环境中的空气洁净度指南（以菌落形成单位 cfu 为单位，使用裂隙琼脂采样器或等效方法进行检测）

等级；类别；阶级		每立方米空气中的菌落形成单位（CFU）	每立方英尺空气中的菌落形成单位（CFU）
SI	“U.S. Customary”通常指的是“美国惯例”或“美国习惯用法”。在制药行业或商业语境中，它可能指美国特定的操作标准、法规要求或行业惯例。例如，在药品生产或质量控制方面，某些流程或要求可能是基于美国GMP（Good Manufacturing Practice）或FDA（Food and Drug Administration）的规定而制定的。
M3.5	100	少于3	小于0.1
M5.5	10,000	少于20	小于0.5
M6.5	100,000	少于100	小于2.5
* 根据1992年9月发布的联邦标准209E的定义。 ** 应采集足够体积的空气样本，以便检测出超出规定限值的异常情况。

表4. 控制环境下设备和设施的表面清洁度指南（以cfu为单位）

等级；类别；阶级		每接触平板的菌落形成单位（CFU per Contact Plate）
SI	美国惯例
M3.5	100	3（包括底层）
M5.5	10,000	5
		10层（楼层）
* 接触板的面积在24到30平方厘米之间。2 在使用拭子进行采样时，覆盖的面积应大于或等于24平方厘米。2 但不得超过30厘米。2 .

表5. 操作人员装备在受控环境中的表面清洁度指南（以菌落形成单位 cfu 计）

等级；类别；阶级		每接触平板的菌落形成单位（CFU per Contact Plate）
SI	美国习惯性的；惯例的；通常的	手套	人员着装 & Garb
M3.5	100	3	5
M5.5	10,000	10	20
* 请参阅（或参见）…… 表4 在（*）的条件下。

空气中有害微生物的定量检测方法与仪器设备

科学家们普遍认为，在受控环境中，空气中的微生物会影响在这些区域生产的中间体或最终产品的微生物质量。同时，也普遍认为用于进行这些检测的仪器和程序可能会影响对空气中微生物的估计结果。因此，当使用替代方法或设备时，应确保所获得的结果具有普遍的等效性。预计未来的技术进步将带来比现有方法更高的精度和灵敏度，这可能会使得检测到的微生物数量的标准发生变化。

如今，在美国制药和医疗器械行业中，最常用的采样器是撞击式采样器和离心式采样器。市面上有许多可供购买的采样器，这里仅列出供参考。选择哪种采样器、判断其是否合适以及是否满足使用需求，完全由用户自行负责。

**裂隙至琼脂空气采样器** （STA） — 这个采样器是依据相关微生物指南进行操作的仪器。表3 这些受控环境的设置是基于特定的标准或规范。该装置由一个可调节真空度的电源驱动。空气通过一个标准化的缝隙进入，缝隙下方放置着一个缓慢旋转的培养皿，其中含有营养琼脂。空气中质量较大的颗粒会撞击琼脂表面，从而使存活的微生物得以生长。通常会使用远程空气吸入系统来尽量减少对层流场的干扰。

筛分冲击机该装置由一个容器组成，该容器用于放置装有营养琼脂的培养皿。容器的盖子上有预先设计好的孔洞，孔洞的大小是固定的。真空泵会将一定体积的空气通过这些孔洞吸入，空气中的微生物颗粒会落在培养皿中的琼脂培养基上。有些采样器配备了多个容器，这些容器上的孔洞大小逐渐减小。通过这些装置，可以确定含有活性微生物的颗粒的大小分布情况，因为不同大小的孔洞会允许不同大小的颗粒落在琼脂平板上。

离心采样器该装置包含一个螺旋桨或涡轮机，它将一定体积的空气吸入装置内部，然后将其向外排出，使空气冲击到放置在柔性塑料基座上的、呈切线方向的营养琼脂条上。

可灭菌的微生物污染区域该单元是单阶段工艺的一种变体。筛选；过滤；细查该装置的盖子上均匀分布着直径约为0.25英寸的孔洞。装置底部可放置一个装有营养琼脂培养基的培养皿。真空泵用于控制空气在装置内的流动，同时配备有多个装置的控制系统以及远程采样探头。

表面空气系统采样器这个集成装置包括一个入口区域，用于放置琼脂接触板。接触板后面紧跟着一个电机和涡轮机，它们将空气通过装置带有孔洞的盖子吸入，并将空气输送到接触板上方；空气随后从电机后方排出。此外，该装置还配备了多个可安装的组件。

明胶过滤器采样器该装置包括一个真空泵，其延长管末端连接着一个过滤器支架，该支架可以放置在关键区域的远程位置。过滤器由随机分布的明胶纤维组成，能够捕捉空气中的微生物。经过规定的暴露时间后，过滤器会被无菌取出，溶解在适当的稀释液中，然后接种到相应的琼脂培养基上，以测定其微生物含量。

沉降板这种方法仍然被广泛使用，因为它是一种简单且成本低廉的定性评估方法，适用于长时间暴露环境的情况。然而，将装有琼脂的培养皿（Petri dishes）或沉降平板（settling plates）暴露在环境中，并不能用于定量估计关键环境中的微生物污染水平。

机械空气采样器的一个主要局限性在于其所能采集的空气样本量有限。在受控环境中，空气中的微生物含量如果过高，环境如果希望获得具有合理精度和准确性的检测结果，那么每立方米空气中所含的微生物数量应不超过三个菌落形成单位（cfu）。然而，在实际操作中，这往往并不现实。为了说明空气中的微生物数量情况…… 环境如果采样频率随时间没有增加，那么可能需要延长采样时间，以确定采样频率是否是限制因素。通常，裂隙式空气采样器的采样能力为每分钟80升（表面空气系统的采样能力稍高）。如果测试一立方米的空气，那么需要15分钟的暴露时间。为了获得具有代表性的环境样本，可能需要使用超过15分钟的采样时间。虽然有一些采样器被报道能够实现非常高的采样速率，但在这些情况下，应考虑这些采样器可能对关键区域的气流模式造成的干扰，或者可能产生的湍流，因为这会增加污染的风险。

对于离心式空气采样器，多项早期研究表明，该采样器对较大颗粒具有选择性。由于这种固有的选择性，使用这种采样器可能会导致空气中微生物的数量比其他类型的空气采样器更高。

在选择离心采样器时，必须考虑采样器对其所在控制区域内气流线性度的影响。无论使用何种类型的采样器，如果采用远程探头，都需要确保额外的管路不会对空气中的活菌计数产生不利影响。这种影响应当被消除；如果无法消除，则应在结果报告中引入一个校正因子。

在受控环境中，用于对表面上的活微生物污染物进行定量检测的采样方法与设备

在受控环境中，微生物环境控制计划的另一个组成部分是对这些环境中使用的设备、设施以及人员装备进行表面采样。与空气采样程序的标准化相比，表面采样方法和程序的标准化在制药行业中的推广程度还不够广泛。为了尽量减少对关键操作的影响，表面采样通常在操作结束后进行。表面采样可以通过以下方式完成：接触板或者通过…… 拭子采样方法表面；外表监控；监测通常，采样会针对与产品接触的区域以及这些接触区域相邻的区域进行。对于规则或不平坦的表面，会使用装有营养琼脂的接触板，并在适当的温度下直接培养一段时间，以确定活菌的数量。对于特定类型的真菌、孢子等的定量检测，可以使用专门的琼脂培养基。

**采样方法可用于不规则表面的取样，尤其是设备表面。对于规则表面，采样通常会结合使用接触板（contact plates）进行。采集的拭子样本需要放入适当的稀释液中处理，但需要注意的是……** **能长期保存** 微生物计数的方法是将适量的样本接种到指定的营养琼脂平板上或琼脂培养基中。需要擦拭的区域会使用一个适当大小的无菌模板来标定。通常，该区域的面积在24到30平方厘米之间。2 微生物的数量估计是按照每个接触平板或每个拭子的数量来报告的。

用于微生物采样或定量培养基及稀释液

在受控环境中用于微生物采样或定量的培养基类型（液体或固体）取决于所采用的程序和设备。当需要固体培养基时，常用的通用培养基是豆胨-酪蛋白消化琼脂（Soybean–Casein Digest Agar）。其他类型的培养基（无论是液体还是固体）列在下面。

液体培养基	固体培养基
胰蛋白胨盐水	大豆酪蛋白消化琼脂
蛋白胨水	营养琼脂
缓冲盐水	胰蛋白胨葡萄糖提取琼脂
缓冲明胶	卵磷脂琼脂
富集缓冲明胶	脑心浸出琼脂
脑心输液	接触平板琼脂
大豆酪蛋白培养基
* 液体和固体培养基均采用经过验证的灭菌工艺进行灭菌处理。

这些介质以脱水形式在市场上销售，同时也提供即用型产品。当…… 消毒剂如果在控制区域内使用了抗生素，应考虑使用含有适当灭活剂的培养基。

可以使用除已列出媒体之外的其他替代媒体，前提是这些媒体已经针对其预期用途通过了验证。

从环境控制程序中分离出的微生物菌株的鉴定

环境控制计划包括对采样所得菌群的适当鉴定。了解受控环境中的正常菌群有助于确定被监测设施中预期的常见微生物菌群；评估清洁和消毒程序、方法及消毒剂的有效性；以及确定微生物的回收方法。通过鉴定程序收集的信息在调查污染源时也非常有用，尤其是在出现污染事件时。行动级别（Action Levels）超出规定范围。

分离株的鉴定来自关键区域及其直接相邻区域的微生物鉴定应优先于来自非关键区域的微生物鉴定。鉴定方法必须经过验证，且即用型试剂盒必须经过确认，以确保其能够满足预期用途（参见……）。环境控制计划设计与实施中的关键因素).

洁净室及其他受控环境中无菌灌装产品的微生物状态的操作评估

受控的环境通过适当的环境监测系统进行监控。监控；监测程序。为确保达到最低的微生物负荷水平，需要提供关于受控区域微生物状况评估的额外信息。环境可以通过使用……获得。 **介质填充（Media Fills）**一个合格的介质填充结果表明，在该时间点，生产线可以成功地进行模拟生产运行。然而，其他因素也同样重要，例如设施的适当建造、环境条件等。监控；监测以及人员的培训。

在开发并安装了无菌生产工艺后，通常需要通过至少三次连续成功的培养基灌装来确认该工艺的微生物状态。培养基灌装过程中使用培养基代替产品来检测微生物的生长情况。在制定培养基灌装程序时，需要考虑以下问题：培养基灌装的操作步骤、培养基的选择、灌装体积、培养时间与温度、灌装单元的检查、记录的保存、结果的解释以及可能需要的纠正措施。

由于介质填充（media fill）的目的是模拟特定产品的无菌生产工艺，因此在介质填充过程中必须确保正常生产运行时的所有条件都得到满足。这包括所有必要的工作人员、以及构成正常生产流程的所有步骤和材料。在进行介质填充时，应预先规划在实际产品生产过程中可能出现的各种干预措施（例如更换填充针头、解决组件卡住等问题）。

或者，为了增加安全裕度，可以采用多种可能条件的组合。例如，可以设置频繁的启动和停止序列、在处理系统发生意外故障时进行维修、更换过滤器等。虽然不需要对每种产品都进行无菌工艺的确认（qualification），但应对每条生产线进行确认。由于容器的几何形状（包括容器开口的大小）以及生产线的速度在使用无菌生产线时都是可变因素，因此在确认生产线时应该适当组合这些因素，最好选择这些因素的极端情况。对于所使用的产品，应当记录其选择理由。

1987年美国食品药品监督管理局（FDA）关于通过无菌生产工艺生产的无菌制剂的指南指出，应进行培养基灌装操作，以覆盖所有生产班次以及生产线/产品/容器组合的情况。该指南不仅适用于培养基灌装操作的确认（qualification），也适用于定期的重新评估或再验证（revalidation）。培养基灌装程序还应模拟长时间生产过程中的实际情况，这可以通过在生产批次结束时进行培养基灌装操作来实现。

一般来说，像大豆酪蛋白肉汤这样用途广泛的培养基，在使用前会通过一系列指示性微生物进行生长促进能力的检测。当微生物数量低于100 cfu/单位时，可以使用。这些微生物是从受控环境中分离出来的。环境在进行无菌处理的地方也可以使用这种方法。培养基经过无菌处理后，装填好的容器会在22.5 ± 2.5℃的温度下进行培养。或者为 32.5 ± 2.5 所有装有培养基的容器至少需要培养14天。如果使用两种温度进行培养，那么这些装有培养基的容器应在每种温度下至少培养7天。培养结束后，应对装有培养基的容器进行生长情况的检查。从培养基中分离出的微生物应按照属进行鉴定，如果可能的话，还应进一步鉴定到种，以便调查污染的来源。

在进行培养基灌装过程中，关键问题包括：需要多少次灌装才能确认无菌工艺的有效性；每次灌装所生产的单位数量；结果的解释方式；以及纠正与预防措施的执行。传统上，在初次确认无菌工艺或设施启动时，会进行三次培养基灌装实验以验证工艺的一致性。为了证明污染率不超过0.1%（这是认定灌装过程成功的标准），至少需要生产3,000个单位的产品。需要强调的是，美国和其他许多国家的许多公司在单次培养基灌装中生产的单位数量远超过3,000个。用于制备小规模临床批次的试验工厂可能会使用更少量的培养基进行灌装。

许多国际文件（例如 ISO 和 EU-GMP）也提出了这样的要求：在 95% 的置信水平下，3,000 个装有培养基的单元中不应出现任何阳性结果。然而，人们认识到需要多次重复进行培养基填充操作，才能确认所观察到的污染率的统计有效性。

PDA技术专论第17号4 “当前无菌生产实践的调查”显示，许多制造商认为他们的无菌生产工艺能够将污染率控制在0.1%以下。

由于洁净室中最主要的污染源是人员，因此鼓励采用可视化记录方式，以便将生产活动与培养基灌装过程中的污染事件联系起来。隔离器系统在无菌检测中的广泛应用已经证明，消除人员接触确实可以减少无菌操作中的污染。

先进无菌生产工艺的新兴技术概述

由于人员在无菌生产过程中的参与和干预与产品污染之间存在密切关联，因此设计了并实施了将人员从关键区域移除的生产系统。为降低污染风险，人们开发了多种方法，包括设备自动化、屏障措施以及隔离系统。采用这些先进无菌生产策略的设施已经投入运行。在那些完全将人员排除在关键区域之外的设施中，根据颗粒物和环境微生物情况对房间进行分类的需求就不再存在了。监控；监测相关要求可能会大幅降低。

以下是一些目前实施的系统的定义，这些系统旨在降低无菌生产过程中的污染率：

障碍；壁垒在无菌生产工艺系统中，屏障是一种用于防止操作人员与屏障内无菌区域接触的装置。这类系统广泛应用于医院药房、实验室、动物护理设施以及无菌灌装过程中。屏障本身可能未经灭菌处理，且通常不具备允许物料在不受外界环境影响的情况下进出系统的传输装置。环境屏障措施包括在关键生产区域周围设置塑料帘子，以及在现代无菌灌装设备上使用坚固的封闭结构。这些屏障还可以包含其他组件，如手套接口、半身防护服和快速传输接口。

灌装/封口工序这种系统将容器的吹塑、产品填充以及密封操作集成到同一台设备中。从微生物学的角度来看，容器的成型、无菌产品的填充以及密封的形成和施加整个过程都是在无菌条件下连续完成的，从而将产品暴露于微生物的风险降至最低。环境这些系统已经存在了大约30年，并且已经证明了其能够将污染率控制在0.1%以下。当汇总和分析吹灌/密封系统的综合数据时，有研究表明污染率可以降至0.001%。

**隔离器** 这项技术具有双重用途。其一是为了防止产品受到污染；环境一种措施是在灌装和封口过程中保护人员安全，另一种措施则是防止人员接触到正在生产的有害或有毒产品。

隔离技术基于以下原理：将已经过灭菌处理的组件（容器、产品或密封件）放置在一个无菌环境中。环境在整个生产过程中，这些组件始终保持无菌状态，因为没有任何人员或非无菌部件被允许进入隔离器。隔离器的屏障是绝对的，它阻止了受保护环境与未受保护环境之间的任何物质交换。隔离器可以通过物理方式密封以防止外部污染的侵入，或者通过持续施加正压来实现有效密封。工作人员对材料的操作必须使用手套、半身防护服或全身防护服进行。所有进入隔离器的空气都必须经过HEPA或UPLA过滤器过滤，而排出的空气通常也会通过HEPA级过滤器。过氧乙酸和过氧化氢蒸汽常被用于隔离器内部表面的灭菌。环境隔离器内部及其所有内容的灭菌过程通常会经过验证，以确保其达到10级的无菌保证水平。 -6.

设备、组件和材料通过多种不同的程序引入隔离器：使用双门高压灭菌器；通过穿过灭菌隧道的传送带连续引入组件；使用通过隔离器外壳内的对接系统传输容器。同时，还需要密切监控隔离器单元的完整性、校准和维护情况。

这些新型无菌生产工艺所要求的受控环境条件，取决于所使用具体的技术类型。

可以将限制员工与产品接触的灌装/密封设备放置在受控区域内。环境特别是在生产过程中，如果有可能进行某种形式的员工干预的话。

屏障系统将需要某种形式的控制措施。环境由于存在多种类型的屏障系统及其应用场景，因此对这些屏障系统的要求也各不相同。环境围绕屏障系统的设计及操作策略将会有所不同。环境制造商必须以逻辑和合理的方式开发围绕这些系统的各项流程。无论采用何种策略，系统生产无菌产品的能力都必须经过验证，以确保其能够按照预先设定的标准进行操作。

在隔离器中，空气通过符合 HEPA 等级或更高等级的集成过滤器进入隔离器内部，其内部通常会进行灭菌处理，以达到 10⁻⁶ 的无菌保证水平。 -6因此，隔离器内部含有无菌空气，不会与周围环境交换空气。环境这些设备是自动化的，且无需人工操作。然而，有人建议，在隔离器处于受控状态时…… 环境如果防护服或手套出现针孔泄漏，导致产品受到污染的风险将会降低。

环境微生物学的范围和领域监控；监测这些先进的无菌生产工艺系统的有效性取决于所使用的具体系统类型。制造商需要在需要人工干预的环境采样系统的频率与这些采样结果所带来的益处之间找到平衡。监控；监测由于屏障系统的设计目的是将人为干预降至最低，因此应使用远程采样系统来替代人工干预。通常情况下，一旦验证确认了屏障系统的有效性，与传统的无菌处理系统相比，监测无菌处理区域微生物状态的采样频率就可以降低。

隔离系统需要相对较少的微生物检测或验证。监控；监测连续总颗粒数监控；监测可以确保隔离器内的空气过滤系统正常运行。本章描述的定量微生物空气采样方法可能灵敏度不足，无法有效检测到…… 环境在隔离器内部。使用隔离器的经验表明，在正常操作条件下，手套上的针孔泄漏或破损是导致微生物污染的主要风险因素；因此，需要定期对手套的完整性及表面进行检测。监控；监测手套的表面处理至关重要。监控；监测在隔离器内进行操作（即使不频繁）也可能有益。

术语表

空气中颗粒物计数（也称为）总颗粒计数—检测到的颗粒大小为0.5微米及以上。当提到颗粒数量时，指的是每立方米空气（或每立方英尺空气）中允许的最大颗粒数。

空气中活菌颗粒计数（也称为）总空气中需氧微生物计数—当规定了具体的微生物数量时，该数值指的是与特定洁净等级（Cleanliness Class）相关的每立方米空气（或每立方英尺空气）中的最大菌落形成单位（colony-forming units, cfu）数量。环境根据…… 空气中颗粒物计数。

无菌生产工艺 —一种药品和医疗产品的加工方式，该方法要求对产品本身以及包装（医疗器械的容器/密封件或包装材料）进行单独灭菌，并在严格控制的微生物环境下将产品转移到容器及其密封件中。

空气采样器 —用于在指定时间内采集一定量空气样本的设备或仪器，以便量化受控环境中空气中的颗粒物或微生物含量。环境.

换气次数（Air Changes） —在受控环境中，空气每单位时间（分钟、小时等）的更换频率。环境空气可以被部分循环使用，或者完全更换。

行动级别（Action Levels） —受控环境中的微生物水平环境根据标准操作规程中的规定，如果任何参数超出规定范围，应立即展开调查，并根据调查结果采取相应的纠正措施。

警戒级别 —微生物水平在标准操作规程中有明确规定；一旦超过这些水平，就必须进行调查以确保生产过程仍在受控状态。警戒水平是针对特定设施设定的，基于在特定环境条件下建立的基础线数据来确定。监控；监测程序。这些警戒级别可以根据趋势分析的结果进行相应的调整。监控；监测程序规定：警戒级别（Alert Levels）始终低于行动级别（Action Levels）。

微生物负荷 —在物品内部或表面检测到的微生物总数。

**洁净室** —一个房间，其空气中的颗粒浓度被控制在符合规定的洁净等级要求。此外，该房间内微生物的浓度也受到严格控制。环境所有区域都受到监控；每个规定的洁净等级都对应着空气、表面和人员装备的微生物污染水平要求。

**洁净区** —一个经过严格控制的区域，在该区域内，空气中的颗粒物和微生物浓度被控制在特定的洁净等级要求范围内。

受控的；受管理的 **环境**：在无菌工艺系统中，任何空气中的颗粒物和微生物水平被控制在特定范围内的区域，这些控制水平需符合该区域内所进行活动的具体要求。环境.

**受控系统的调试与启动** 环境 —— 通过工程和质量控制的认证，确保…… 环境该设施已按照所需的洁净等级要求进行建造，并且在正常操作条件（或最坏情况下）下，能够确保实现无菌生产过程。调试过程包括使用培养基进行填充实验以及环境监测的结果。监控；监测程序；计划；项目

纠正与预防措施（CAPA） —根据标准操作规程（SOP）规定的、在某些条件超出规定范围时需要执行的操作。

环境分离株 —从环境中分离出的微生物监控；监测程序；计划；项目

环境 **监控计划** —— 一种有书面记录的计划，通过标准操作规程来实施，详细说明了用于……的程序和方法。监控；监测在受控环境中（空气、表面、人员装备），需要监测颗粒物和微生物的存在。该计划规定了采样点、采样频率，以及当检测结果超过警戒水平或行动水平时应采取的调查和纠正措施。同时，还描述了用于趋势分析的方法论。

设备布局 — 一种用于表示无菌生产系统中设备与人员之间关系的图形化展示。这种布局被应用于…… 风险评估分析根据产品/容器/密封系统可能存在的微生物污染风险，确定采样地点和采样频率。任何变更都必须由相关负责人进行评估，因为设备布局或人员站点的未经授权的变更都可能增加产品/容器/密封系统被污染的风险。

联邦标准209E “洁净室和洁净区的空气颗粒物洁净度等级”是由联邦供应服务局（Federal Supply Services）局长批准的一项标准，适用于所有联邦机构。该标准根据空气中颗粒物的具体浓度来划分不同的洁净度等级。这些洁净度等级主要是为电子行业的“超洁净”控制环境制定的。在制药行业中，联邦标准209E用于规定洁净环境的建造要求。环境在无菌生产工艺中，通常使用“Class 100”、“Class 10,000”和“Class 100,000”这样的分类等级。如果分类系统是基于粒径大于或等于0.5微米的颗粒来制定的，那么根据国际单位制（SI）的标准，这些等级分别对应于“Class M3.5”、“Class M5.5”和“Class M6.5”。

过滤器完整性 —进行测试以确保过滤器的功能性能符合要求（例如，二辛基邻苯二甲酸酯（DOP）检测和气泡点测试）。

物料流动 —物料和人员的流动进入受控环境时，必须遵循既定且经过记录的路径，这一路径的选择旨在减少或消除产品、封闭系统或容器系统受到微生物污染的风险。任何偏离规定路径的行为都可能增加微生物污染的可能性。虽然可以调整物料或人员的流动方式，但相关管理人员必须从微生物学的角度评估这些调整可能带来的后果，并确保这些调整得到授权并记录在案。

**介质生长促进** —指代某程序或操作的术语生长促进在...的指导下；按照...的要求无菌检查 á71ñ 为了证明用于微生物环境的培养基或介质符合相关标准或要求。监控；监测 “program, or in” 可以翻译为“在……的范围内”或“按照……的程序/计划进行”。这个短语用于说明某个活动或过程是按照既定的程序、计划或规则来执行的。例如：“所有操作都必须在规定的程序内进行”（All operations must be carried out within the prescribed procedures）。 **媒体填充（Media Fill）** 这些运行条件能够支持指示性微生物的生长，并且具备... 环境分离株从通过……获得的样本中监控；监测程序或相应的 ATCC 菌株。

**介质填充（Media Fill）** —通过使用与产品处理方式相似的培养基，并采用相同的容器/密封系统，来进行无菌工艺的微生物模拟实验。

超标事件 —当受控环境的标准操作规程中的一项或多项要求未被满足时，无论这种状态是暂时的还是持续的。

产品接触区域 —受控环境中的区域和表面环境与产品、容器或密封件直接接触的区域，其微生物状况可能导致产品/容器/密封件系统受到潜在的微生物污染。一旦发现这些区域，应比非产品接触区域或表面更频繁地进行检测。

风险评估分析 —在受控环境中分析污染的潜在来源，确定这些污染的严重程度和发生频率的优先级；同时制定相应的方法和程序，以消除、减少、最小化或减轻微生物对产品/容器/密封系统的污染风险。

取样计划 —一份书面计划，详细描述了对受控产品进行抽样的程序和方法。环境; 明确了采样点、采样频率以及样本数量；并描述了分析方法以及如何解读分析结果。

取样点 —记录在案的地理位置，位于受控区域内。环境在进行微生物评估的采样时，采样点通常选择那些可能接触到产品、容器或封口的部位。

标准操作规程（SOP）书面程序，详细描述了在受控环境中进行的操作、测试、取样、结果解读以及与这些操作相关的纠正措施。环境以及辅助环境。任何偏离标准操作规程的情况都应被记录下来，并需得到负责经理的批准。

无菌环境；无菌区域 —在无菌生产环境或其他受控环境中，微生物污染风险最高的地方是位于或高于开放产品容器、密封件或产品本身的那个区域。

无菌状态；无菌性根据最严格的无菌定义，当一个物品中完全不存在任何活的微生物时，该物品就被认为是无菌的。实际上，如果不对批次中的每一个物品都进行检测，就无法证明其绝对无菌。无菌性是用概率来定义的，即物品被污染的可能性被认为非常低、可以接受。

拭子 —用于采样不规则表面和规则表面以确定微生物状态的设备。这种拭子通常由一根带有吸水端的棒组成，在采样前会被湿润，然后用来擦拭指定面积的表面。采样后，拭子会用无菌生理盐水或其他合适的溶剂冲洗，其内容物会被接种到营养琼脂平板上，以估算该表面上的活微生物数量。

趋势分析 —来自常规微生物环境监测的数据监控；监测该程序可能与时间、班次、设施等因素相关。这些信息会定期进行评估，以确定该程序的现状或运行模式，从而判断其是否处于受控状态。通过趋势分析，可以为程序的重新确认（如安装确认、运行确认、性能确认等）提供决策支持。环境或者用于维护和清洁计划。