1.0 目标
制定标准操作规程（SOP）的目的是为直接接种法（Direct Inoculation Method）的无菌检测提供操作指南。2.0 范围
该程序适用于在无法通过膜过滤法进行检测的生产地点制造的产品。3.0 责任
实施：微生物学家4.0 责任追究
执行：质量控制（QC）经理
审核与批准：AGM - 质量保证（QA）/ 质量控制（QC）部门
5.1.2 中间体样品的采集：从LVP瓶包装机中随机收集16个预先灭菌的瓶子样本进行无菌检测，确保每个瓶子代表瓶包装机模具中的不同腔室。
5.1.3 将样品转移到QC部门，并使用干净的塑料箱进行包装。
5.1.4 用拭子单独擦拭每个样品部件。 70%异丙醇溶液 并放置在干净的不锈钢托盘中。 标有“产品名称、批号和批次号”的样品，需通过洁净区域后转移至无菌室。 **传递箱（Pass Box）** 用于执行无菌检查。
5.1.5 按照要求准备培养基试管（FTM和SCDM）。 培养基制备的标准操作规程（SOP）将100-100毫升的培养基分装到试管中并密封（对于油性产品，在FTM和SCDM培养基中加入10-10克/升的聚山梨酯80）。按照规定，将这两种培养基在121ºC和15磅/平方英寸的压力下进行20分钟的灭菌处理。 《高压灭菌法用于培养基灭菌的标准操作规程》.
5.1.6 在高压灭菌后，需在试管上标注培养基的名称和培养基批次号。随后将培养基试管在适当的温度下进行预培养：SCDM试管在20至25ºC下培养，FTGM试管在30至35ºC下培养24至48小时，之后再进行无菌处理。
5.1.7 根据标准操作规程（SOP），将灭菌布和带有棉塞的锥形瓶分别放入不锈钢容器中，于121ºC和15 psi的压力下进行30分钟的高压灭菌处理。同时，将100毫升注射用水（WFI）在121ºC和15 psi的压力下进行20分钟的高压灭菌处理，作为阴性对照。
5.1.8 将预培养的无菌培养基试管、SCDA平板和无菌拭子通过传递箱转移到无菌检测室。
5.1.9 按照规定进入无菌室。 无菌室进出程序.
5.1.10 按照 LAF 操作规程（SOP）启动 LAF（可能是指某种设备或系统的操作流程）。
5.1.11 用70%的异丙醇溶液擦拭所有需要检测无菌性的样品。
5.1.12 在开始无菌检查之前，根据标准操作规程（SOP），将SCDA培养皿放置在测试过程中规定的位置。
5.1.13 检查工作用层流柜（LAF）的压力表读数，并监测无菌室的温度和湿度。
5.1.14 工作压力的压力表读数 LAF（Low-Air-Frequency）灭菌柜 压力应保持在08至15毫米水柱之间。无菌室的温度应控制在27ºC ± 2ºC范围内。
5.1.15 使用无菌不锈钢刀片在煤气灯前切割瓶子或安瓿的尖端，然后立即将整个安瓿的内容物无菌地转移到无菌锥形烧瓶中。同样地，将所有20个安瓿的内容物转移到无菌锥形烧瓶中并混合。
5.1.16 现在从锥形瓶中取10毫升样品，转移到100毫升的无菌FTM试管中。同样地，将10毫升样品转移到100毫升的无菌SCDM试管中。
5.1.17 在每个试管上标注产品名称、批号、检测日期、完成日期以及检测人员姓名。
5.1.18 同时准备一个阴性对照样本：将10-10毫升的无菌注射用水（WFI）转移到100-100毫升的无菌磷酸盐缓冲液（FTM）和硫酸软骨素D（SCDM）试管中，并将这两个试管都标记为“阴性对照”。
5.1.19 在进行无菌操作时，同时准备一个对照样品：取两支试管，一支装有SCDM（无菌挑战物质），另一支装有FTM（无菌测试介质）。在无菌操作过程中，拔掉试管的棉塞并将试管暴露在层流空气中（LAF）。无菌操作完成后，重新塞上棉塞，然后将这两支试管作为对照样品进行培养。
5.1.20 在完成工作交接后，将所有接种过的培养基通过传送装置转移至微生物分析部门，同时将所有设备和暴露过的培养板也转移至该部门进行微生物分析。
5.1.21 按照《无菌室进出规程》（SOP）中规定的退出程序，立即离开无菌区域。
5.1.22 将FTM管在30ºC至35ºC的温度下培养14天，SCDM管在20ºC至25ºC的温度下培养14天。根据IP规定，最终灭菌产品的培养时间不得少于7天，而无菌灌装产品的培养时间为14天。如果产品符合USP或BP标准，则最终灭菌产品和无菌灌装产品的培养时间均为14天。
5.1.23 按照标准操作规程（SOP）启动微生物分析室的实验室空气洁净度（LAF）测试。通过无菌操作，将10至100个菌落形成单位（cfu）的金黄色葡萄球菌（S. aureus NCIM 2079）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa NCIM 2200）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis NCIM 2063）以及环境菌群接种到FTM培养基试管中，制备四支阳性对照管。同样地，分别将约10至100个细胞的白念珠菌（C. albicans NCIM 3471）、黑曲霉（A. niger NCIM 1196）以及环境菌群接种到SCDM培养基试管中，制备三支阳性对照管。将FTM阳性对照管置于30–35ºC下培养3天，SCDM阳性对照管置于20–25ºC下培养5天。
相关： 用于培养真菌和细菌的常见培养基的孵育条件
5.2.2 如果在任何试管中均未观察到生长现象，则表明该待检测产品符合无菌测试的要求。
5.2.3 该测试结果无效，除非阴性对照在培养结束时仍呈阴性，且阳性对照在规定的培养时间内显示出生长现象。
5.2.4 在FTM和SCDM试管中确认有菌生长后，销毁所有阳性对照品。
5.2.5 如果在任何试管中发现微生物生长的迹象，应按照相关要求调查其失败的原因。 无菌检查失败调查的标准操作规程如果调查报告认定该测试结果无效，需使用20个样品重新进行测试。
5.2.6 如果重复测试中没有发现微生物生长的迹象，则所检测的产品符合无菌测试的要求；如果重复测试中发现了微生物生长的迹象，则所检测的产品不符合无菌测试的要求。
5.3.2 任何用于无菌操作或无菌室内的材料都必须经过适当的高压灭菌处理。
5.3.3 在使用无菌加热切割刀片切割样品瓶/小瓶之前，应先在燃气炉前适当加热瓶子/小瓶的瓶口部分。
5.3.4 在完成无菌操作后，立即清洁废液储存容器，并用经过过滤的70%异丙醇和无菌拖把擦拭容器的外表面。
相关： 将培养皿倒置培养。
QA：质量保证
QC：质量控制
NA: 不适用
IPA：异丙醇
SVP: 小容量注射剂
LVP：大容量注射剂
FTM：硫代葡萄糖酸盐液体培养基
SCDM：大豆酪蛋白消化培养基
IP：印度药典
BP：英国药典
USP：美国药典
审核与批准：AGM - 质量保证（QA）/ 质量控制（QC）部门
5.0 程序
5.1 直接接种法
5.1.1 制剂样品的采集：收集用于无菌检测的样品。从每批样品中随机选取20件样品（LVP和SVP各20件），用于后续检测。 终端灭菌产品 以及无菌灌装的产品。5.1.2 中间体样品的采集：从LVP瓶包装机中随机收集16个预先灭菌的瓶子样本进行无菌检测，确保每个瓶子代表瓶包装机模具中的不同腔室。
5.1.3 将样品转移到QC部门，并使用干净的塑料箱进行包装。
5.1.4 用拭子单独擦拭每个样品部件。 70%异丙醇溶液 并放置在干净的不锈钢托盘中。 标有“产品名称、批号和批次号”的样品，需通过洁净区域后转移至无菌室。 **传递箱（Pass Box）** 用于执行无菌检查。
5.1.5 按照要求准备培养基试管（FTM和SCDM）。 培养基制备的标准操作规程（SOP）将100-100毫升的培养基分装到试管中并密封（对于油性产品，在FTM和SCDM培养基中加入10-10克/升的聚山梨酯80）。按照规定，将这两种培养基在121ºC和15磅/平方英寸的压力下进行20分钟的灭菌处理。 《高压灭菌法用于培养基灭菌的标准操作规程》.
5.1.6 在高压灭菌后，需在试管上标注培养基的名称和培养基批次号。随后将培养基试管在适当的温度下进行预培养：SCDM试管在20至25ºC下培养，FTGM试管在30至35ºC下培养24至48小时，之后再进行无菌处理。
5.1.7 根据标准操作规程（SOP），将灭菌布和带有棉塞的锥形瓶分别放入不锈钢容器中，于121ºC和15 psi的压力下进行30分钟的高压灭菌处理。同时，将100毫升注射用水（WFI）在121ºC和15 psi的压力下进行20分钟的高压灭菌处理，作为阴性对照。
5.1.8 将预培养的无菌培养基试管、SCDA平板和无菌拭子通过传递箱转移到无菌检测室。
5.1.9 按照规定进入无菌室。 无菌室进出程序.
5.1.10 按照 LAF 操作规程（SOP）启动 LAF（可能是指某种设备或系统的操作流程）。
5.1.11 用70%的异丙醇溶液擦拭所有需要检测无菌性的样品。
5.1.12 在开始无菌检查之前，根据标准操作规程（SOP），将SCDA培养皿放置在测试过程中规定的位置。
5.1.13 检查工作用层流柜（LAF）的压力表读数，并监测无菌室的温度和湿度。
5.1.14 工作压力的压力表读数 LAF（Low-Air-Frequency）灭菌柜 压力应保持在08至15毫米水柱之间。无菌室的温度应控制在27ºC ± 2ºC范围内。
5.1.15 使用无菌不锈钢刀片在煤气灯前切割瓶子或安瓿的尖端，然后立即将整个安瓿的内容物无菌地转移到无菌锥形烧瓶中。同样地，将所有20个安瓿的内容物转移到无菌锥形烧瓶中并混合。
5.1.16 现在从锥形瓶中取10毫升样品，转移到100毫升的无菌FTM试管中。同样地，将10毫升样品转移到100毫升的无菌SCDM试管中。
5.1.17 在每个试管上标注产品名称、批号、检测日期、完成日期以及检测人员姓名。
5.1.18 同时准备一个阴性对照样本：将10-10毫升的无菌注射用水（WFI）转移到100-100毫升的无菌磷酸盐缓冲液（FTM）和硫酸软骨素D（SCDM）试管中，并将这两个试管都标记为“阴性对照”。
5.1.19 在进行无菌操作时，同时准备一个对照样品：取两支试管，一支装有SCDM（无菌挑战物质），另一支装有FTM（无菌测试介质）。在无菌操作过程中，拔掉试管的棉塞并将试管暴露在层流空气中（LAF）。无菌操作完成后，重新塞上棉塞，然后将这两支试管作为对照样品进行培养。
5.1.20 在完成工作交接后，将所有接种过的培养基通过传送装置转移至微生物分析部门，同时将所有设备和暴露过的培养板也转移至该部门进行微生物分析。
5.1.21 按照《无菌室进出规程》（SOP）中规定的退出程序，立即离开无菌区域。
5.1.22 将FTM管在30ºC至35ºC的温度下培养14天，SCDM管在20ºC至25ºC的温度下培养14天。根据IP规定，最终灭菌产品的培养时间不得少于7天，而无菌灌装产品的培养时间为14天。如果产品符合USP或BP标准，则最终灭菌产品和无菌灌装产品的培养时间均为14天。
5.1.23 按照标准操作规程（SOP）启动微生物分析室的实验室空气洁净度（LAF）测试。通过无菌操作，将10至100个菌落形成单位（cfu）的金黄色葡萄球菌（S. aureus NCIM 2079）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa NCIM 2200）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis NCIM 2063）以及环境菌群接种到FTM培养基试管中，制备四支阳性对照管。同样地，分别将约10至100个细胞的白念珠菌（C. albicans NCIM 3471）、黑曲霉（A. niger NCIM 1196）以及环境菌群接种到SCDM培养基试管中，制备三支阳性对照管。将FTM阳性对照管置于30–35ºC下培养3天，SCDM阳性对照管置于20–25ºC下培养5天。
相关： 用于培养真菌和细菌的常见培养基的孵育条件
5.2 结果的观察与解读
5.2.1 在实验期间，每天对培养基试管进行目视检查，直至实验结束，以观察是否有微生物生长的宏观迹象。5.2.2 如果在任何试管中均未观察到生长现象，则表明该待检测产品符合无菌测试的要求。
5.2.3 该测试结果无效，除非阴性对照在培养结束时仍呈阴性，且阳性对照在规定的培养时间内显示出生长现象。
5.2.4 在FTM和SCDM试管中确认有菌生长后，销毁所有阳性对照品。
5.2.5 如果在任何试管中发现微生物生长的迹象，应按照相关要求调查其失败的原因。 无菌检查失败调查的标准操作规程如果调查报告认定该测试结果无效，需使用20个样品重新进行测试。
5.2.6 如果重复测试中没有发现微生物生长的迹象，则所检测的产品符合无菌测试的要求；如果重复测试中发现了微生物生长的迹象，则所检测的产品不符合无菌测试的要求。
5.3 注意事项
5.3.1 在将样品瓶/小瓶转移到无菌室之前，应使用过滤后的70%异丙醇（IPA）进行彻底擦拭；在无菌室内进行操作之前，同样需要再次擦拭。传递箱也应用过滤后的70% IPA溶液进行清洁。5.3.2 任何用于无菌操作或无菌室内的材料都必须经过适当的高压灭菌处理。
5.3.3 在使用无菌加热切割刀片切割样品瓶/小瓶之前，应先在燃气炉前适当加热瓶子/小瓶的瓶口部分。
5.3.4 在完成无菌操作后，立即清洁废液储存容器，并用经过过滤的70%异丙醇和无菌拖把擦拭容器的外表面。
相关： 将培养皿倒置培养。
6.0 缩写
标准操作规程（SOP）QA：质量保证
QC：质量控制
NA: 不适用
IPA：异丙醇
SVP: 小容量注射剂
LVP：大容量注射剂
FTM：硫代葡萄糖酸盐液体培养基
SCDM：大豆酪蛋白消化培养基
IP：印度药典
BP：英国药典
USP：美国药典