动物细胞培养中的生长，细胞培养的一般程序

动物细胞在适宜的环境中通过人工培养的方式生长，形成动物细胞培养物。

用于动物培养的细胞应来源于多细胞真核生物及其已建立的细胞系。
动物细胞培养技术是在人工条件下从动物体内分离并培养细胞的方法。
通过这项专为特定实验室研究开发的技术，细胞系可以与其原始来源保持独立性，从而作为一个独立的实体进行维护。
为了开发动物细胞培养技术，首先制备了基础的组织培养基，以便能够在各种条件下培养多种不同类型的细胞。
从各种动物中分离出的细胞已在体外培养，以帮助揭示不同的功能及其行为机制。
癌症研究、疫苗生产和基因治疗是动物细胞培养应用最广泛的领域之一。
在人工培养基上生长的细胞比微生物需要更多的营养物质和生长因子，因为它们的生长速度较慢。
目前，人工培养基既能够用于培养已经分化的细胞，也能够用于培养尚未分化的细胞。
体外动物细胞培养可以使用不同类型的细胞进行启动，而体外器官培养则需要利用像器官这样的复杂结构来进行启动。
根据具体目的和应用需求，培养过程可以使用任何类型的组织、细胞或器官。

如何准备细胞传代

对培养箱进行灭菌处理时，需要先使用紫外线（UV）进行照射。
如果您正在使用之前存储在4°C下的介质，请先让其升温至室温。
用70%的乙醇冲洗一下通风橱内部。
用酒精冲洗后，将所有必要的物品存放在生物安全柜内。
为了丢弃培养瓶中的使用过的培养基，必须在生物安全柜（hood）内进行操作。
在显微镜下观察，确认细胞是否已经融合（即细胞是否紧密连接在一起）。确保这些细胞是健康的。
汇合的细胞绝对不能被分开。这样做会对细胞造成压力。请小心、轻柔地处理这些细胞，因为它们非常脆弱。
手应用70%的乙醇进行清洁。
需要将胰蛋白酶（Trypsin）和乙二胺四乙酸（EDTA）预先加热至37°C，以便进行细胞裂解。
为了移除用过的培养基，使用移液器将内容物从融合培养的烧瓶中吸出。
使用；采用磷酸盐缓冲液用生理盐水清洗你的单层细胞一次。
接下来，向单层细胞培养物中加入1毫升的胰蛋白酶/EDTA溶液，然后让其静置。
应移除胰蛋白酶溶液。
将烧瓶放置在BOD培养箱中，温度设定为37°C，保持大约一分半钟的时间。
轻轻敲击烧瓶的侧面，以使细胞脱落。
在将细胞移除后，应使用2-3毫升浓度为10%的完全DMEM培养基将它们冲洗掉。
在1500转/分钟的速度下观察离心后的细胞管5分钟。
它会形成细胞团块。
将2毫升的DEMEM培养基倒入颗粒上并使其溶解。
应使用血细胞计数器来计数细胞数量，并将细胞转移到新的培养瓶中以维持细胞系。
如果烧瓶受到污染，请在24小时后进行检查。
这个培养瓶需要定期分瓶，以便长期维持细胞系（最多可传代30次）。

细胞培养的类型

原代细胞培养

细胞通常是通过直接培养组织并让它们生长直到覆盖整个培养基表面（达到汇合状态）来扩增的。

为了进行原代培养，首先需要将器官从组织中分离出来，然后再从组织中分离出细胞。可以使用胰蛋白酶溶液来完成这一过程。

随后，细胞会在新配制的、针对特定细胞类型的培养基中培养，并在支持细胞生长的条件下放入培养箱中进行培养。
初次培养的细胞在经过第一次传代培养后，被称为细胞系或亚克隆。

次级细胞培养

“二次培养”是指从已经达到汇合状态的初次培养物中分离出细胞，并将其在新的培养基中重新培养的过程。
细胞分裂（Cell splitting）是继代培养（secondary culture）或亚培养（subculture）的另一种说法。
由于含有新鲜的营养物质，细胞在传代培养中可以更容易地增殖。
使用胰蛋白酶/EDTA将细胞从原代培养物中分离出来。
这是一种丝氨酸蛋白酶，能够分解细胞外的蛋白质或基质蛋白，从而释放出细胞。
EDTA（乙二胺四乙酸）这种螯合剂能够与钙离子结合，而钙离子在细胞之间的黏附过程中起着关键作用。

细胞系

从原代细胞培养而来的细胞被称为细胞系。虽然细胞系的基因型和表型可能有所改变，但它们通常与原代细胞具有相似的特性。存在多种不同的细胞系，每种细胞系具有独特的表型，或者某些细胞系的表型彼此相似。

根据细胞的生长模式，这些细胞系可以进一步分为两组；

有限细胞系

具有有限分裂次数的细胞系最终会死亡，而具有无限分裂次数的细胞系则可以无限期地分裂。
有限数量的细胞在死亡前可以分裂20到100次，之后就无法再分裂了。
细胞分裂的次数和持续时间受多种因素影响，包括细胞类型、物种、培养条件以及培养基的种类。

连续细胞系

它们的生长速度非常快，以至于能够形成独立的菌落。如果细胞是永生的（即不会死亡），它们就可以无限分裂下去。
基因的改变也可能导致连续细胞系转变为肿瘤细胞。
当原代细胞培养物被致癌病毒感染或接触到导致癌症的化学物质时，它们会发生转化（即发生基因突变或结构改变，从而失去正常的生长和分化能力）。
悬浮的细胞可以在液体培养基中生长，并且能够形成更高的细胞密度。
即使在彼此堆叠的情况下，细胞也能在培养容器中形成多层结构。

有限细胞系与连续细胞系

有限细胞系由那些只能分裂有限次数、之后会失去增殖能力的细胞组成（即发生衰老）。
那些能够无限增殖的细胞经过了改造，例如通过化学或病毒手段诱导产生的细胞。它们被称为连续细胞系（continuous cell lines）。
锚定依赖性（anchorage dependence）是具有有限生长速率和接触抑制（contact inhibition）的细胞的特征。
不断生长的细胞不会受到接触或锚定抑制的影响，它们的生长速度也不会变慢。
固定细胞系的细胞以单层培养的形式生长，这意味着它们会均匀地覆盖培养容器的底部。
在悬浮培养（而非附着培养）中，可以培养出连续的单层细胞。

将细胞在液氮中冷冻的过程

在胰蛋白酶处理后，融合培养的培养瓶中会形成一种沉淀物，这种沉淀物会溶解在DMEM培养基中。
细胞密度可以通过计数细胞来确定。
之后，将200万到300万个细胞分别放入每个冷冻管中。
这种培养基由含有10% FBS（胎牛血清）和10% DMSO（二甲基亚砜）的DMEM培养基组成。二甲基亚砜（DMSO）具有冷冻保护作用，可以防止冰晶的形成。
冻存管应先冷却至-80°C，第二天再在液氮中进一步冷却。
使用这种方法，我们的细胞系可以保存很长时间。