1.0 目标
制定高效液相色谱（HPLC）仪器的校准程序和频率。2.0 范围
该程序适用于检查…… 高效液相色谱（HPLC）的校准 **四级梯度系统（Quaternary Gradient system）**安装在质量控制实验室的设备为：型号为 LC 2010 C、LC 2010 C HT，制造商为岛津（Shimadzu）。
3.0 责任
3.1 职位：技术助理/执行员3.2 检查人员：执行人员/经理
4.0 责任制
部门负责人5.0 频率：每三个月一次。
6.0 程序/规程
6.1 按照相应的标准操作规程操作仪器。6.2 泵的校准
6.2.1 将流速设置为 1.0 毫升/分钟。6.2.2 将一根内径为0.1毫米、长度为2米的Resisto管连接到色谱柱的位置上。
6.2.3 启动泵，等待设备稳定或达到基线值。
6.2.4 称量干燥的、空的状态下的 A 级量筒的重量。再次称量并记录该重量。
6.2.5 收集电阻管出口处流出的水5分钟，然后称量测量筒的重量，并记录下这个数值。
6.2.6 重复步骤 6.2.5，并继续此过程四次。
6.2.7 计算流速的准确性。
6.3 检测器的波长精度
6.3.1 通过按下功能键，启动 LC 2010 C 和 LC 2010 C HT 设备。6.3.2 按下 VP 键。
6.3.3 按下功能键，然后按 F5。
6.3.4 按下5键选择检测器。
6.3.5 按下右箭头键，进入下一个屏幕（共5个屏幕中的第2个）。
6.3.6 按下向下箭头键七次（确保光标在“z波”参数处闪烁），然后输入数字1并按回车键。
6.3.7 按下“Press Func”键，然后按“F5”键退出程序。
6.3.8 按下“Met Key”按钮。
6.3.9 用甲醇冲洗流动池。
6.3.10 打开检测器的端口，使用注射器注入甲醇进行清洗。
6.3.11 按下“归零”键，确保吸光度值为零。
6.3.12 注入5毫升浓度为2毫克/100毫升的咖啡因甲醇溶液，将波长从266纳米逐步调整到277纳米（每次增加1纳米），并记录相应的吸光度值。
6.3.13 记录产生最大吸光度的波长。
6.3.14 记录结果。
6.4 结果的可重复性
6.4.1 准备流动相，其组成为70%甲醇和30%水。6.4.2 准备一份含有0.1%（体积比）苯和0.1%（体积比）甲苯的甲醇混合物。
6.4.3 将流速设置为 1 毫升/分钟。
6.4.4 在注入样品制备液之前，让系统至少与流动相充分接触（即让系统饱和流动相）15分钟。
6.4.5 记录苯和甲苯的面积以及相对保留时间。
6.4.6 分别计算面积和相对保留时间的相对标准偏差（RSD）。
6.4.7 面积的相对标准偏差（RSD）不应超过2.0%；苯和甲苯的相对保留时间（RRT）也不应超过2.0%。
6.4.8 计算拖尾因子（不对称性）、分辨率以及理论板数和记录。
6.5 程序文件检查
6.5.1 在电脑上点击“开始”菜单。6.5.2 进入“Programs”（程序）并选择“Chromatography”（色谱法）。
6.5.3 点击程序修改测试。
6.5.4 程序文件检查窗口将会打开，点击“执行”（Execute）。
6.5.5 软件会检查所有文件并给出结果。
6.5.6 如果所有文件均通过检查，系统将显示“Check is finished”以及“Integrity Check Passed”。
6.5.7 点击记事本查看文件的状态。
6.5.8 在记事本窗口中点击文件，然后选择“打印”进行输出。
6.5.9 如果发现某些文件存在问题，系统会显示“Check is finished <
6.5.10 点击记事本查看文件的状态。
6.5.11 在这种情况下，请联系服务工程师。
6.5.12 记录程序文件的状态。
6.6 线性测试：
6.6.1 准备流动相，其组成为70%甲醇和30%水。6.6.2 标准溶液的制备：配制一份含有0.2%苯和0.2%甲苯的甲醇溶液。
按照以下方法进行稀释。
6.6.3 分别取5毫升、10毫升、15毫升、20毫升的储备溶液，加入到25毫升的体积溶液中，然后用甲醇补足体积至刻度线。
6.6.4 将流速设置为 1.0 毫升/分钟。
6.6.5 在注入不同溶液之前，让系统至少充满流动相（mobile phase）15分钟。
6.6.6 记录苯和甲苯的面积。
6.6.7 分别计算苯和甲苯的线性度。
6.7 持续性测试（Carry Over test）：
6.7.1 在完成线性测试后，注入20微升甲醇。6.7.2 计算携带量测试（Carry Over test）的结果。
6.8 四元梯度精度测试：
6.8.1 将 Resisto 软管（长度2米，内径0.1毫米）连接到仪器上。6.8.2 准备0.3%的丙酮溶液，溶剂为纯化水。
6.8.3 将流动相按照以下要求加入系统中。
A：纯化水
B、C、D：纯水中含有0.3%的丙酮。
6.8.4 将流速设置为 1.0 毫升/分钟。
6.8.5 将波长设置为254纳米。
6.8.6 设置时间程序。
6.8.7 调整基线水平，以适应积分器的整个测量范围。
6.8.8 启动梯度性能的时间程序。
6.8.9 确定信号水平分别为 0%（B 浓度为 0）、10%（B 浓度为 10）、50%（B 浓度为 50）、90%（B 浓度为 90）和 100%（B 浓度为 100）。
6.8.10 确定信号水平分别为 0%（浓度 C 为 0）、10%（浓度 C 为 10）、50%（浓度 C 为 50）、90%（浓度 C 为 90）和 100%（浓度 C 为 100）。
6.8.11 确定信号水平分别为 0%（D 浓度 0）、10%（D 浓度 10）、50%（D 浓度 50）、90%（D 浓度 90）和 100%（D 浓度 100）。
6.8.12 计算 B10、B50、B90、C10、C50、C90 以及 D10、D50、D90 的浓度。
6.8.13 如果获得的相对标准偏差（RSD）在规定的范围内，则仪器的性能是令人满意的；否则，应按照标准操作规程（SOP）进行处理。
6.9 柱温箱和样品冷却盘的温度精度测试：
6.9.1 使用校准过的温度计测量烤箱内的实际温度以及样品冷却托盘的温度，并将其与设定值进行比较。6.9.2 柱温箱温度准确度测试程序。
6.9.2.1 温度准确度的设定是通过“性能检查”来测量的。
6.9.2.2 按下 [VP] [F3 (VALID)] [2] [Enter] 键，然后从 “Performance Check” 菜单中选择 “5 oven Temperature”。
6.9.2.3 根据屏幕上的指示，选择需要测量的 40°C 和 50°C 温度。
6.9.2.4 使用夹具将校准后的温度传感器固定在设备内部加热块下层台阶的中央位置。
6.9.2.5 按下[OVEN]键开始温度调整。温度稳定后，系统将自动测量5分钟内的温度波动幅度。
6.9.2.6 记录实际温度值与校准后的温度计值，分别对应30分钟、45分钟和60分钟的时间间隔。
6.9.3 样品冷却盘温度准确性测试程序
6.9.3.1 按下 [Seq] 和 [F1] 键，然后输入“4”以设置“冷却器温度”（自动温度设定参数）。
6.9.3.2 在方法屏幕的其他参数部分中，输入“1”到“SMPL.C”。
6.9.3.3 将冷却架（R）放置在主设备中，并将校准过的温度计探头放入样品冷却托盘内。
6.9.3.4 等待温度稳定在设定值，因为通常需要大约90分钟的时间。
6.9.3.5 按下 [VP] F3（VALID）[2][Enter] 键，然后在 “Performance Check”（性能检查）中选择 “11. 冷却器温度”。
6.9.3.6 记录实际温度值与校准后的温度计读数之间的差异，分别对应30分钟、45分钟和60分钟的时间间隔。
7.0 缩写
RRT：相对保留时间%: 百分比。
ml: 毫升
RSD：相对标准偏差。
RT：保留时间
v/v: 体积 / 容量
另请参阅： 高效液相色谱（HPLC）中的相对响应因子（RRF）计算