在药品制造过程中，最重要的工序之一就是灭菌，尤其是对于那些需要保持无菌状态的产品而言。灭菌的成功与否将直接影响所生产产品的安全性、质量，以及最终消费者的健康。在制药行业中，使用生物指示剂（Biological Indicators, BIs）是一种被广泛认可的方法，用以验证灭菌过程是否有效，从而确保产品既安全又有效。
生物指示剂是一种具有抗性的微生物，用于检测灭菌过程的条件，以证明灭菌程序达到了预期的效果。仅使用生物指示剂本身并不能确保灭菌过程的有效性；其性能特征也必须经过验证。这是根据药品生产质量管理规范（GMP）的要求，该规范由监管机构制定。生物指示剂的验证是灭菌过程有效性保障的重要组成部分。
它们用于确认灭菌条件足以杀死耐药性微生物。典型的生物指示物包括：
具有一定抗性的微生物孢子。
2. 载体材料；例如：条带、圆盘、安瓿或悬浮液。
3. 一种保护性包装。
由于已知微生物孢子具有极强的抗破坏性，如果灭菌过程能够成功杀死这些孢子，那么就可以证明该灭菌过程是有效的。
1. 无菌效果的确认。
2. 灭菌工艺的验证。
3. 常规监测。
4. 保护患者。
5. 符合监管要求。
与物理或化学指标不同，生物指标能够直接提供灭菌过程是否成功的微生物学证据。
D值越高，生物指示物的抗性就越强。
灭菌循环的有效性
指标的挑战等级
- 这种特定微生物存在于指示菌中。
- 孢子数量是准确的。
- 这些抗性特性是可以接受的。
- 这种回收方法是非常可靠的。
- 无菌工艺
- 微生物类型
- 接受标准
- 测试方法
该方案的目的是证明该微生物既适合作为生物指示剂，又具有可靠性。
通过执行以下验证任务来进行验证：
所用菌株的确认
用于生物指示物的微生物的纯度确认。
根据供应商的认证文件，对相关微生物进行确认。
这将确保使用正确的抗性生物指示剂。
从生物指示剂中回收孢子
进行系列稀释
进行微生物平板计数
将微生物平板计数结果与质量标准进行比较
所有结果必须符合预先设定的验收标准。
为了确定 D 值，请执行以下测试：
将生物指示剂置于灭菌条件下，并在不同时间间隔内进行检测。
- 从生物指示剂中回收存活的孢子。
- 从回收的孢子中计算对数减少值（log reduction）。
- 用数学方法计算 D 值。
这将证明该生物指示物对灭菌过程具有足够的挑战性（即能够有效检测灭菌效果）。
**存活时间（Survival Time）**：指示剂能够保持其功能状态的最短时间。
**杀灭时间（Kill Time）**：指能够确保所有目标指标（共3项）被完全破坏所需的最短时间。
这样做是为了证明/符合灭菌循环在指示物性能方面的可预测性。
将遵循以下程序：
将微生物培养在适宜的生长培养基中。
**微生物生长的验证**
确认该培养基能够支持微生物的生长与回收。
如果回收方法不充分，可能会导致获得假阴性结果的风险。
验证方法将包括：
**培养箱温度的验证**
**培养时间的确认**
**生长培养基适用性测试**
不同的微生物对培养条件（如温度、湿度、培养时间等）有不同的要求。
将遵循以下程序：
向培养基中接种低密度的微生物菌群。
按照规定的条件进行培养（或孵育）。
观察微生物的生长情况。
微生物的成功生长表明该培养基适合用于微生物的回收。
必须保存以下文件：
验证方案
- 原始数据
- 测试结果
- 计算
- 最终报告
完整的文件记录将证明符合药品生产质量管理规范（GMP）的要求。
接受标准的示例：
微生物鉴定（或正确的微生物识别）
- 足够的孢子数量
- D值在规定的参数范围内
活菌的回收率
观察到的存活和死亡微生物的预期数量
如果上述任何一项标准未得到满足，就需要对原因进行全面调查。
- 变化的孢子计数
培养条件不正确
微生物回收效率低下
- 测试过程中的污染
通过确保在验证过程中执行适当的计划并采用无菌技术，可以降低上述问题的发生几率。
典型应用：
监控高压灭菌器的灭菌循环
灭菌器的确认（Qualification of Sterilizers）
**装载物验证（Load Validation）**
常规使用生物指示剂（BI）通过持续验证有效的灭菌过程来帮助控制灭菌效果。
- 灭菌周期的变更
- 生物制品（BI）供应商的变更
- 孵化方法的变化
灭菌器的改造
定期进行审查将确保生物指示物的持续可靠性。
科学依据；合理解释
**适当的验证**
- 常规监测
充分的文件记录
如果生物指示物（BI）没有经过适当的验证，可能会导致在检查过程中受到监管机构的关注或处罚。
- 使用经过认证的生物指示剂。
- 遵循标准的微生物检测方法。
- 彻底验证回收方法的有效性。
- 保持完整的记录。
- 适当培训员工。
遵循这些最佳实践将有助于确保工作的有效性和合规性。
在制药生产中，灭菌效果的保证依赖于对生物指示物的验证。生物指示物的验证证明了它们是可靠的、稳健的，并且适合作为监测灭菌过程的工具。
通过制定结构化的验证程序并配备相应的文件记录，制药制造商能够确保有效的灭菌控制措施。这些程序和文件将为他们提供监管支持，证明经过验证的生物指示物能够有效证明灭菌方法始终能够保障产品质量和患者安全。
- 如果灭菌周期发生了变化
- 如果生物制品（BI）的供应商发生了变更
- 如果检测方法发生了变更
生物指示剂到底是什么？
生物指示剂是由一定数量的活性微生物组成的，这些微生物经过特殊处理后被制成标准化格式或制剂，并且对某种特定的灭菌技术具有已知的抗性。它们用于确认灭菌条件足以杀死耐药性微生物。典型的生物指示物包括：
具有一定抗性的微生物孢子。
2. 载体材料；例如：条带、圆盘、安瓿或悬浮液。
3. 一种保护性包装。
由于已知微生物孢子具有极强的抗破坏性，如果灭菌过程能够成功杀死这些孢子，那么就可以证明该灭菌过程是有效的。
生物指标的重要性
生物指示剂是评估灭菌技术效果最准确的方法之一，因为它们能够提供微生物被彻底杀灭的确切证据，从而判断灭菌过程是否有效。生物指示剂可用于：1. 无菌效果的确认。
2. 灭菌工艺的验证。
3. 常规监测。
4. 保护患者。
5. 符合监管要求。
与物理或化学指标不同，生物指标能够直接提供灭菌过程是否成功的微生物学证据。
生物指示物的类型
有效的灭菌需要使用不同类型的生物指示剂。蒸汽灭菌指示剂
蒸汽灭菌通常使用嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的孢子来进行。这些孢子对蒸汽的杀菌效果具有极强的抵抗力。2. 干热灭菌指示剂
干热灭菌系统通常使用枯草芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）孢子进行测试。3. 乙烯氧化物（ETO）灭菌指示物
萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）的孢子也是环氧乙烷（ETO）灭菌效果评估的首选生物指示剂。4. 过氧化氢灭菌指示剂
过氧化氢灭菌过程会使用专门为该工艺设计的生物指示剂进行检测；然而，这些指示剂中会含有专门适用于蒸汽过氧化氢灭菌过程的孢子。生物指示物的关键特性
用于监测药品灭菌过程有效性的生物指示物的特性必须包括：- 对所采用的灭菌方法的抗性
- 随着时间的推移，保持孢子种群稳定性的能力
- 孢子群体的性能保持一致。
- 在孢子暴露于灭菌过程后，能够轻松恢复其活性（即孢子能够重新具备繁殖能力）。
什么是D值？
D值是指在特定条件下，确保90%的微生物种群被消除或微生物数量减少1个对数单位所需的时间。D值越高，生物指示物的抗性就越强。
D值的重要性
D值可用于确定：灭菌循环的有效性
指标的挑战等级
生物指示物的验证
生物制品（BI）的验证强调这些生物制品适合其预期用途，并且能够产生一致的结果。验证确保了以下几点：- 这种特定微生物存在于指示菌中。
- 孢子数量是准确的。
- 这些抗性特性是可以接受的。
- 这种回收方法是非常可靠的。
为什么需要进行验证？
如果生物指示物（Biological Indicators, BIs）不准确或不可靠，可能会导致错误的检测结果。因此，这可能会引起以下问题：- 非无菌制剂的放行
- 不必要的批次拒收
- 违反法规
生物指示物的验证程序
验证需要一个结构化的流程。步骤1：明确范围和目标
验证方案必须明确规定以下内容：- 无菌工艺
- 微生物类型
- 接受标准
- 测试方法
该方案的目的是证明该微生物既适合作为生物指示剂，又具有可靠性。
步骤2：验证微生物的身份。
必须对生物指示物进行验证，以确认用于生物指示物装置中的微生物的身份。通过执行以下验证任务来进行验证：
所用菌株的确认
用于生物指示物的微生物的纯度确认。
根据供应商的认证文件，对相关微生物进行确认。
这将确保使用正确的抗性生物指示剂。
步骤3：验证孢子数量
生物指示剂必须含有指定数量的孢子。孢子数量的验证是通过以下方法完成的：从生物指示剂中回收孢子
进行系列稀释
进行微生物平板计数
将微生物平板计数结果与质量标准进行比较
所有结果必须符合预先设定的验收标准。
步骤4：确定D值
生物指示物的抗性是通过其D值来评估的。为了确定 D 值，请执行以下测试：
将生物指示剂置于灭菌条件下，并在不同时间间隔内进行检测。
- 从生物指示剂中回收存活的孢子。
- 从回收的孢子中计算对数减少值（log reduction）。
- 用数学方法计算 D 值。
这将证明该生物指示物对灭菌过程具有足够的挑战性（即能够有效检测灭菌效果）。
步骤5：存活与杀灭时间研究
本研究的目的是确定该指标在经过灭菌处理后的性能表现。**存活时间（Survival Time）**：指示剂能够保持其功能状态的最短时间。
**杀灭时间（Kill Time）**：指能够确保所有目标指标（共3项）被完全破坏所需的最短时间。
这样做是为了证明/符合灭菌循环在指示物性能方面的可预测性。
步骤6. 回收方法验证
在对指示物进行灭菌处理后，必须能够检测到任何存活的微生物。将遵循以下程序：
将微生物培养在适宜的生长培养基中。
**微生物生长的验证**
确认该培养基能够支持微生物的生长与回收。
如果回收方法不充分，可能会导致获得假阴性结果的风险。
步骤7. 孵育条件的验证
在适当的条件下培养对于微生物的成功生长至关重要。验证方法将包括：
**培养箱温度的验证**
**培养时间的确认**
**生长培养基适用性测试**
不同的微生物对培养条件（如温度、湿度、培养时间等）有不同的要求。
步骤8. 生长促进试验
用于回收的培养基必须为微生物的生长提供足够的支持。将遵循以下程序：
向培养基中接种低密度的微生物菌群。
按照规定的条件进行培养（或孵育）。
观察微生物的生长情况。
微生物的成功生长表明该培养基适合用于微生物的回收。
步骤9. 文件记录与报告编制
所有验证活动都必须进行适当的记录。必须保存以下文件：
验证方案
- 原始数据
- 测试结果
- 计算
- 最终报告
完整的文件记录将证明符合药品生产质量管理规范（GMP）的要求。
验收标准
验证方案必须包含基于客观标准的验收准则，以评估这些生物指标。接受标准的示例：
微生物鉴定（或正确的微生物识别）
- 足够的孢子数量
- D值在规定的参数范围内
活菌的回收率
观察到的存活和死亡微生物的预期数量
如果上述任何一项标准未得到满足，就需要对原因进行全面调查。
生物制品验证中的常见挑战
在验证生物指标的过程中，组织可能会遇到一些常见的挑战：- 变化的孢子计数
培养条件不正确
微生物回收效率低下
- 测试过程中的污染
通过确保在验证过程中执行适当的计划并采用无菌技术，可以降低上述问题的发生几率。
使用生物指示剂进行常规监测
在初次验证之后，应常规使用生物指示物（BI）来监测灭菌过程。典型应用：
监控高压灭菌器的灭菌循环
灭菌器的确认（Qualification of Sterilizers）
**装载物验证（Load Validation）**
常规使用生物指示剂（BI）通过持续验证有效的灭菌过程来帮助控制灭菌效果。
重新验证要求
生物指示物重新验证的触发因素可能包括：- 灭菌周期的变更
- 生物制品（BI）供应商的变更
- 孵化方法的变化
灭菌器的改造
定期进行审查将确保生物指示物的持续可靠性。
法规要求
监管机构要求生物指标必须满足以下要求：科学依据；合理解释
**适当的验证**
- 常规监测
充分的文件记录
如果生物指示物（BI）没有经过适当的验证，可能会导致在检查过程中受到监管机构的关注或处罚。
生物指示物验证的最佳实践
关于生物指示物验证的最佳实践建议包括：- 使用经过认证的生物指示剂。
- 遵循标准的微生物检测方法。
- 彻底验证回收方法的有效性。
- 保持完整的记录。
- 适当培训员工。
遵循这些最佳实践将有助于确保工作的有效性和合规性。
在制药生产中，灭菌效果的保证依赖于对生物指示物的验证。生物指示物的验证证明了它们是可靠的、稳健的，并且适合作为监测灭菌过程的工具。
通过制定结构化的验证程序并配备相应的文件记录，制药制造商能够确保有效的灭菌控制措施。这些程序和文件将为他们提供监管支持，证明经过验证的生物指示物能够有效证明灭菌方法始终能够保障产品质量和患者安全。
关于生物指示物验证的常见问题解答（FAQs）
Q1. 生物指示剂的用途是什么？
答案：生物指示物（Biological Indicators，简称BI）是一种无菌的、商业化生产的、具有抗性的孢子。医护人员可以使用它们来验证灭菌过程的有效性，即“我的灭菌过程是否成功？”Q2. 生物指示物的价值是什么？
答案：这些方法已经经过科学验证，属于邮购产品，并且能够提供直接的证据，证明用于对物体进行灭菌的条件是有效的（即灭菌过程确实达到了预期的效果）。Q3. What are the organisms used in the tests, and why are they specifically chosen?
答案：作为生物指示菌最常用的两种微生物是嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）和萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。Q4. 什么是D值？
答案：D值是指在受控实验室条件下，将活孢子（微生物）的数量减少90%所需的时间，或者说是达到这一效果所需的时间段。Q5. 什么是生物指示物验证？
答案：生物指示物（BI）的验证确保了所选生物指示物既具有可靠性，又能有效抵抗目标微生物；同时，也验证了这些生物指示物的检测结果本身的可靠性。Q6. 回收验证（Recovery Validation）的价值是什么？
**答案：** 在经过灭菌循环处理后进行该操作，以确保能够准确计数存活的微生物数量。Q7. 请明确说明在什么情况下需要进行验证（Validation）或重新验证（Re-validation）。
**答案：** 需要进行重新验证（Revalidation）。- 如果灭菌周期发生了变化
- 如果生物制品（BI）的供应商发生了变更
- 如果检测方法发生了变更