1.0 目的
制定原料药和成品的微生物限度检测程序，以确定微生物负荷并确认不存在规定的微生物。2.0 范围
该程序适用于在质量控制部门接收和检测的材料。该程序不适用于在其他部门接收和检测的材料。3.0 责任
微生物学家4.0 责任制
部门主管5.0 程序/规程
5.1 微生物计数试验及特定微生物检测
5.1.1 将待检测的产品/样品溶解或稀释（按照1:10的比例）于无菌溶液中。 缓冲氯化钠 蛋白胨溶液（pH 7.0）或按照规定制备的大豆酪蛋白消化培养基 培养基制备的标准操作规程（Standard Operating Procedure for Media Preparation）.5.1.2 如果需要进一步稀释，请使用与上述相同的稀释剂进行稀释。
5.2 微生物计数试验：采用倾注平板法测定总需氧菌计数（TAMC）和总酵母菌及霉菌计数（TYMC）。
5.2.1 根据第5.1.1点的要求，从制备好的溶液/悬浮液中无菌转移1毫升到四个容器中的每一个容器里。 无菌培养皿.
5.2.2 在两个培养皿中分别加入约15-20毫升按照标准操作规程（SOP）制备的无菌大豆酪蛋白消化琼脂（冷却至约45°C），用于检测TAMC（总霉菌和酵母计数）；在另外两个培养皿中加入约15-20毫升按照标准操作规程制备的无菌沙氏葡萄糖琼脂（冷却至约45°C），用于检测TYMC（总酵母计数）。
5.2.3 通过轻轻旋转培养皿来混合其内容物，确保样品充分混合，然后让培养基固化。在操作过程中要小心不要让培养基从培养皿中溢出。
5.2.4 对于每种培养基，应使用1毫升稀释液代替样品进行接种，以同时进行阴性对照实验。
5.2.5 将大豆酪蛋白消化琼脂平板在30°C至35°C下培养5天，以检测总霉菌计数（TAMC）；将沙氏葡萄糖琼脂平板在20°C至25°C下培养5天，同时将平板倒置放置，以检测酵母菌和霉菌计数（TYMC）。
相关： 用于培养真菌和细菌的常见培养基的孵育条件
5.3 微生物计数试验：采用过滤法测定总需氧菌数以及总酵母菌和霉菌数。
5.3.1 使用 膜过滤器 具有不大于0.45微米的孔径。硝酸纤维素滤膜可用于水溶液、油性溶液和低浓度酒精溶液；醋酸纤维素滤膜则适用于高浓度酒精溶液；此外，PVDF等其他合适的膜材料也可使用。
5.3.2 将等量的样品（在验证过程中确定的数量，相当于1克或1毫升）从制备好的溶液/悬浮液中（按照步骤5.1.1的方法制备），无菌地转移到两个膜过滤器中，并立即进行过滤。
5.3.3 用三份约100毫升的0.1%蛋白胨水冲洗每个过滤器，具体冲洗量需根据验证结果确定。
5.3.4 将一个膜过滤器转移到按照TAMC操作规程制备的预培养大豆酪蛋白消化琼脂平板表面，将另一个膜过滤器转移到按照TYMC操作规程制备的沙氏葡萄糖琼脂平板表面。
5.3.5 对每种培养基，使用100毫升稀释液代替样品进行过滤，同时进行阴性对照实验。
5.3.6 将大豆酪蛋白消化琼脂（Soybean Casein Digest Agar）和沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud Dextrose Agar）的培养皿在30°C至35°C的温度下培养5天，以检测TAMC（总霉菌和酵母计数）；同时将培养皿在20°C至25°C的温度下培养5天，以检测TYMC（总酵母计数）。培养过程中需保持培养皿处于直立状态。
如果TYMC（可能指某种微生物指标）因在含有抗生素的Sabouraud Dextrose Agar培养基上生长而超出验收标准，可以使用相应的处理方法。
5.4 结果的观察与表达
5.4.1 在培养期结束后，观察培养皿中的菌落情况，并将结果表示为每克/毫升的菌落形成单位（CFU）。计算方法是将每个培养皿的平均菌落数乘以稀释倍数。如果未观察到菌落，则结果表示为少于稀释倍数的菌落数。记录下该结果。5.4.2 如果在大豆酪蛋白消化琼脂上检测到真菌菌落，这些菌落将被计入总霉菌和酵母计数（TAMC）；如果在沙氏葡萄糖琼脂上检测到细菌菌落，这些菌落将被计入总酵母计数（TYMC）。
5.4.3 如果由于菌落数量过多或菌落融合而无法进行计数，则应对溶液/悬浮液进行进一步稀释（例如1:10等），然后重新进行总数测试。
5.4.4 负对照平板不应出现任何菌落生长；任何负对照结果不合格的情况都应进行调查。
5.4.5 如果检测到的TAMC（总霉菌计数）和TYMC（酵母菌计数）超出规定范围，请按照以下步骤操作： 《超标（OOS）样品处理标准操作规程》.
5.5 指定微生物检测的样品制备
5.5.1 按照标准操作规程（SOP）准备培养基。5.5.2 对于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）的检测，应使用不少于1克或1毫升的样品进行制备；或者使用稀释比例为1:10的样品（即1毫升样品对应1克样品），将其溶解或稀释在100毫升无菌大豆酪蛋白消化培养基（Sterile Soybean Casein Digest Medium）中，然后在30至35°C的温度下培养18至24小时。培养完成后，按照以下方法分别检测各微生物。
5.5.3 对于耐胆汁的革兰氏阴性菌的检测，应使用不少于1克或1毫升的样品，或者按照不少于1克或1毫升样品的比例进行10倍稀释，然后将其溶解或稀释在10毫升无菌大豆酪蛋白消化培养基中。混合后，在20至25°C的温度下孵育，孵育时间应足以使细菌复苏，但不足以促进细菌繁殖（通常为2小时，最长不超过5小时）。孵育完成后，按照以下方法进行耐胆汁革兰氏阴性菌的检测。
5.5.4 对于梭菌的检测，应使用不少于2克或2毫升的样品进行制备；或者使用不少于2克或2毫升样品的1:10稀释液进行制备。将样品溶解或稀释到10毫升的无菌大豆酪蛋白消化培养基中，然后按照以下方法进行梭菌检测。
5.5.5 对于白色念珠菌（Candida albicans）的检测，应使用不少于1克或1毫升的样品进行制备，或者使用稀释比例为1:10的样品（即1毫升样品稀释至10毫升），然后将其转移到100毫升的Sabouraud葡萄糖培养基中，并在30至35°C的温度下培养3至5天。培养完成后，按照以下方法进行白色念珠菌的检测。
5.5.6 阴性对照：在每个测试阶段，对于每种培养基，应同时进行阴性对照测试，并使用无菌的SCM（可能是某种培养基或试剂）而不是样品本身进行测试。
5.6 检测金黄色葡萄球菌
5.6.1 在按照第5.5.2节的方法制备好大豆酪蛋白消化培养基后，将培养基从试管中取出，使用接种环将其接种到甘露醇盐琼脂（MSA）平板上，并进行划线培养。5.6.2 将平板翻转过来，然后在30°C至35°C的温度下培养18至72小时。
5.6.3 孵育后，观察培养皿。如果出现黄色或白色的菌落，并且这些菌落周围有一圈黄色区域，那么就可以判断存在金黄色葡萄球菌（S. aureus）。
5.6.4 如果发现符合上述描述的菌落，应使用进一步的方法进行鉴定。 **Biomeriux** 按照标准操作规程（SOP）执行。
5.6.5 如果没有观察到所描述的菌落类型，或者如果…… **鉴别试验** 如果结果为阴性，则该产品符合金黄色葡萄球菌的检测要求。
5.6.6 记录实验结果。
5.7 铜绿假单胞菌检测
5.7.1 在培养大豆酪蛋白消化培养基（按照5.5.2节的方法制备）后，将培养基从试管中取出，使用接种环将其内容物涂布在含有西曲米德琼脂（Cetrimide Agar）的平板上。5.7.2 将平板翻转过来，然后在30°C至35°C的温度下培养18至72小时。
5.7.3 孵育后，观察培养皿中的菌落生长情况，可以判断是否存在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
5.7.4 如果发现菌落，应按照标准操作规程（SOP）使用 Biomeriux 进行进一步鉴定。
5.7.5 如果未观察到菌落生长，或者鉴定测试结果为阴性，则该产品符合铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的检测要求。
5.7.6 记录实验结果。
5.8 沙门氏菌检测
5.8.1 在按照第5.5.2点制备好大豆酪蛋白消化培养基后，将培养基试管中的内容物用无菌移液器混合均匀，然后取0.1毫升转移到10毫升的Rappaport Vassiliadis沙门氏菌增菌肉汤（RSB）中，然后在30°C至35°C的温度下培养18至24小时。5.8.2 孵育后，将试管内的内容物混合均匀，然后用接种环从 RSB 培养基中取一环菌液，接种到 Xylose lysine Deoxycholate agar (XLD) 培养基平板上。
5.8.3 将培养皿翻转过来，然后在30°C至35°C的温度下培养18至48小时。
5.8.4 孵育后，检查培养皿。如果出现生长良好、呈红色的菌落（菌落中心可能为黑色或非黑色），则表明可能存在沙门氏菌。
5.8.5 如果发现符合上述描述的菌落，应按照标准操作规程（SOP）使用 Biomeriux 进行进一步鉴定。
5.8.6 如果未观察到所描述的菌落类型，或者鉴定测试结果为阴性，则该产品符合沙门氏菌检测的要求。
5.8.7 记录实验结果。
5.9 大肠杆菌检测
5.9.1 在孵育了根据第5.5.2节制备的大豆酪蛋白消化培养基后，使用无菌移液管将1.0毫升该培养基转移到含有100毫升麦康凯氏肉汤（MacConkey’s broth）的试管中，然后在42°C至44°C的温度下孵育24至48小时。5.9.2 孵育后，将试管内的内容物混合均匀，然后用接种环从 MacConkey’s 肉汤培养基中取一环菌液，接种到 MacConkey’s 琼脂培养基平板上。随后在 30°C 至 35°C 的温度下培养 18 至 72 小时。 **倒置位置**.
5.9.3 菌落的生长表明可能存在大肠杆菌（Escherichia coli）。
5.9.4 如果发现菌落，应按照标准操作规程（SOP）使用 Biomeriux 进行进一步鉴定。
5.9.5 如果未观察到菌落，或者鉴定测试结果为阴性，则该产品符合大肠杆菌（Escherichia coli）的检测要求。
5.9.6 记录实验结果。
5.10 耐胆汁的革兰氏阴性菌检测
5.10.1 对步骤5.5.3中获得的耐胆汁的革兰氏阴性菌进行检测。5.10.2 将按照5.5.3节的方法制备的大豆酪蛋白消化培养基在培养后进行混合。
5.10.3 检测是否存在：
5.10.3.1 使用相当于1克或1毫升产品的体积，将5.5.3节中提到的制剂接种到100毫升的EEB Mossel培养基中。然后在30°C至35°C的温度下，以倒置的状态培养24至48小时。
5.10.3.2 孵育后，将试管内的内容物混合，并将其接种到紫色红胆汁葡萄糖琼脂平板上以进行选择性分离。将平板置于30°C至35°C的温度下培养18至24小时。
5.10.3.3 如果未观察到菌落，则该产品符合耐胆汁革兰氏阴性菌的检测要求。
5.10.4 定量检测
5.10.5.1 用5.5.3节中提到的制剂分别接种适量的EEB Mossel菌株，接种量分别为0.1克、0.01克和0.001克（或0.1毫升、0.01毫升、0.001毫升），然后将其接种到待检测的产品中。在30°C至35°C的温度下培养24至48小时。
5.10.5.2 将每种稀释液接种到含有葡萄糖的紫红色胆汁琼脂平板上，进行二次培养以获得选择性分离。将平板置于30°C至35°C的温度下培养18至24小时。
5.10.5.3 解释：菌落的生长表示检测结果为阳性。记录产生阳性结果的最小样品量以及产生阴性结果的最大样品量。根据下表确定细菌的估计数量。
每种产品的数量结果
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每克/毫升样品中可能的细菌数量由于您提供的内容仅为“l”这一个字母，它没有明确的含义或翻译成中文的依据。请提供更多的上下文或信息，以便我能够为您提供准确的翻译。 产品相关；与产品有关的
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0.1克/米由于您提供的内容仅为“l”这一个字母，它没有明确的含义或翻译成中文的依据。请提供更多的上下文或信息，以便我能够为您提供准确的翻译。
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0.01克/米由于您提供的内容仅为“l”这一个字母，它没有明确的含义或翻译成中文的依据。请提供更多的上下文或信息，以便我能够为您提供准确的翻译。
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0.001克/米由于您提供的内容仅为“l”这一个字母，它没有明确的含义或翻译成中文的依据。请提供更多的上下文或信息，以便我能够为您提供准确的翻译。
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< 102 以及超过10个
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<10
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5.11 检测梭菌
5.11.1 按照步骤 5.5.4 的描述准备待检测的产品，取两份相等量的样品，每份样品的质量或体积分别为 1 克或 1 毫升。5.11.2 将其中一份样品加热至80°C并保持10分钟，然后迅速冷却；另一份样品则不需要加热。
5.11.3 将每份均质化后的样品（10毫升，或相当于1克/毫升的量）分别转移到两个含有100毫升强化培养基（Reinforced Medium for Clostridia）的试管中。
5.11.4 在厌氧条件下，于30°C至35°C的温度下孵育48小时。
5.11.5 孵育完成后，从每个添加了庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养管中取样进行传代培养。
5.11.6 在厌氧条件下，于30°C至35°C的温度下孵育48至72小时。
5.11.7 如果观察到微生物的厌氧生长，则需要进行革兰氏染色和过氧化氢酶测试。
5.11.8 按照规定进行革兰氏染色。 微生物染色操作规程.
5.11.9 在催化酶测试中，将一滴过氧化氢滴在干净的载玻片上，然后用接种环（不要使用镍铬环）取一部分疑似菌落，将其与过氧化氢混合。如果观察到氧气气泡的产生，则说明催化酶测试结果为阳性；如果没有观察到氧气气泡，则说明结果为阴性。
5.11.10 如果观察到呈阴性的过氧化氢酶反应的厌氧杆菌（无论是否含有内孢子）生长，说明存在梭菌（Clostridia）。
5.11.11 如果在哥伦比亚琼脂上未检测到微生物的厌氧生长，或者过氧化氢酶测试呈阳性，则该产品符合针对梭菌（Clostridia）的检测要求。
5.12 白色念珠菌检测
5.12.1 在完成沙氏葡萄糖培养基（按照5.5.5节的步骤制备）的培养后，将沙氏葡萄糖培养基试管内的内容物混合均匀，然后用接种环从培养基中取出一环菌液，将其接种到沙氏葡萄糖琼脂平板上。随后在30°C至35°C的温度下培养24至48小时。5.12.2 在培养后，如果培养皿中出现白色菌落，则表明存在白色念珠菌（Candida albicans）。
5.12.3 如果发现符合上述描述的菌落，应按照标准操作规程（SOP）使用 Biomeriux 进行进一步鉴定。
5.12.4 如果没有出现所描述的菌落类型，或者鉴定测试结果为阴性，则该产品符合白色念珠菌（Candida albicans）的检测要求。
5.13 阴性对照：在每个测试阶段，对于每种培养基，都需要同时进行阴性对照测试。
5.14 结果的解释
5.15.1 如果未观察到任何特征性生长，或者鉴定测试结果为阴性，则该产品符合“不存在指定微生物”的测试要求。5.15.2 阴性对照品不应出现任何生长现象；任何阴性质控结果不合格的情况都应进行调查。
5.15.3 如果检测结果不符合标准，请按照标准操作规程（SOP）进行处理。“对于微生物检测中出现的超标结果，应按照相应的处理程序进行操作。”
6.0 缩写词
6.1 标准操作规程（Standard Operating Procedure）6.2 m - 毫升
6.3 克
6.4 °C - 摄氏度
6.5 CFU - 菌落形成单位
6.6 EEB Mossel – 莫斯尔肠杆菌富集培养基
6.7 TAMC - 总需氧菌计数
6.8 TYMC - 总酵母菌和霉菌计数
6.9 PVDF - 聚偏二氟乙烯