1.0 目标
本方案的目的是建立书面证据，以证明干热灭菌器（热风烘箱）的灭菌循环能够有效破坏/灭活所检测到的细菌内毒素。2.0 范围
该方案适用于安装在质量控制部门微生物实验室中的干热灭菌器。3.0 职责
**高级编号**
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活动；活性；运作
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责任；职责
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1
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方案开发
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质量控制（Quality Control）
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2
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执行本方案
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质量控制（QC）；质量保证（QA）
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3
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结果评估
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质量控制（Quality Control）
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4
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最终批准
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AGM - 质量保证（Quality Assurance）
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4.0 先决条件
为了高效地使用内毒素指示物进行DHS验证，请确保满足以下要求：- 已批准的 BET 测试程序
- 已批准的热风烘箱（干热灭菌器）操作规程
- 内毒素指示物
- 已清洗的BET管 – 12支，每支75毫米长
- 去热原处理过的75毫米长检测管，数量为10支
- 去热原处理过的稀释管，13支，每支长度100毫米。
- 裂解物 – 敏感性：0.03 EU/ml
- LRW – LAL试剂用水
- 校准过的加热块
- 校准过的微量移液器
- 无菌微针头，不含细菌内毒素
- 计时器
- 试管架
5.0 设备/系统描述
1. 地点：质量控制部门微生物学组的清洗区2. 设备：这些设备包括用于进行DHS和BET测试的设施所需的所有仪器。
3. 系统描述：干热灭菌器用于对用于检测的试管及其他玻璃器皿进行去热原处理。 细菌内毒素 以及 热原干热灭菌器（热风烘箱）在250°C下加热1小时，以破坏细菌内毒素。
6.0 关键控制参数/监测参数的识别：
在使用内毒素指示剂对干热灭菌器进行验证之前，需要监测以下参数。7.0 验证测试
A. 标记裂解物敏感性的确认
按照制造商在瓶子和随附证书中提供的说明，将CSE重新配制到LAL试剂水（LRW）中，然后使用涡旋仪搅拌5到10分钟。2. 使用实验室用水（LRW）配制一系列浓度为1EU/ml的CSE稀释液，并在涡旋混合器中振荡混合5分钟。
3. 准备4升的稀释液：将浓度为1 EU/ml的溶液稀释至所需体积，最终得到4升的稀释液。使用涡旋混合器将稀释液振荡混合5分钟。（4升的最终体积需要根据具体的浓度来计算，其中“l”代表裂解液的灵敏度单位。）
4. 从4升的溶液中制备四种不同浓度的CSE稀释液，这些浓度分别相当于2升、1升、1/2升和1/4升的浓度。具体方法是通过用水逐步稀释CSE溶液来达到所需的浓度。 BET (LRW).
5. 现在，使用无菌刀片打开裂解液的铝封，然后重新配制裂解液。
6. 将裂解液粉末轻轻敲击在硬表面上，使其收集到小瓶的底部。然后缓慢打开瓶塞。
根据制造商的说明，在使用前加入稀释液（LRW），并立即更换软木塞。
8. 取24支经过去热原处理的检测管，对每支管进行编号并标记；将每组4支管（四联份）整齐地排列好后，按照下表中的步骤进行操作。
样品
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使用了CSE稀释液。
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LRW
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溶菌液（体积单位：毫升）
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重复次数
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2升
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100毫升的2升溶液
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-
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100毫升
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4
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由于您提供的内容仅为“l”这一个字符，它没有明确的含义或翻译成中文的依据。请提供更多的上下文或信息，以便我能够为您提供准确的翻译。
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100毫升的l
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-
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100毫升
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4
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l/2
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100毫升的l/2
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-
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100毫升
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4
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l/4
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100米/升（m/l）
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-
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100毫升
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4
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WNC
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-
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100毫升
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100毫升
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4
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9. 用移液器分别将100毫升稀释后的CSE溶液（浓度分别为1、1/2和1/4）吸取到去热原处理的硼硅酸盐试管（尺寸为10毫米×75毫米）中，并分别进行标记。对于WNC（水阴性对照），使用100毫升蒸馏水（LRW）进行同样的操作，每个实验重复四次（四重复）。
10. 向每个试管中加入100毫升复溶后的裂解液，然后轻轻混合。
11. 将反应混合物在37° ± 1°的温度下恒温孵育60 ± 2分钟，期间避免振动。
12. 孵育结束后，取出每个试管，直接从培养箱中取出并迅速将其倒置约180度。如果形成了一个牢固的凝胶并且在倒置后仍然保持原位，则记录结果为阳性。如果没有形成完整的凝胶，则结果为阴性。
13. 除非标准溶液的最低浓度在所有重复试验中均显示阴性结果，否则该测试无效。
14. “终点”是指在内毒素浓度逐渐降低的一系列检测结果中最后一个呈阳性的结果。计算这些终点浓度的对数值的平均值，然后使用以下公式计算该平均值的反对数：
10. 向每个试管中加入100毫升复溶后的裂解液，然后轻轻混合。
11. 将反应混合物在37° ± 1°的温度下恒温孵育60 ± 2分钟，期间避免振动。
12. 孵育结束后，取出每个试管，直接从培养箱中取出并迅速将其倒置约180度。如果形成了一个牢固的凝胶并且在倒置后仍然保持原位，则记录结果为阳性。如果没有形成完整的凝胶，则结果为阴性。
13. 除非标准溶液的最低浓度在所有重复试验中均显示阴性结果，否则该测试无效。
14. “终点”是指在内毒素浓度逐渐降低的一系列检测结果中最后一个呈阳性的结果。计算这些终点浓度的对数值的平均值，然后使用以下公式计算该平均值的反对数：
验收标准
几何平均终点浓度是指裂解物溶液的测量灵敏度（单位为EU/ml或IU/ml）。如果该浓度不小于0.5l且不大于2l，则标记的灵敏度得到确认，可以用于后续的验证工作。B. 内毒素挑战试验
2. 加入5毫升稀释液（LRW，浓度为95,000,000欧姆/毫升，每支小瓶的稀释液量为5毫升，因此总浓度为19,000,000欧姆/毫升），然后使用涡旋仪混合15分钟。
3. 取15支75毫米和13支100毫米的稀释管，并在每支管子上贴上标签A。
4. 在试管A中加入0.1毫升（储备液）+ 1.8毫升稀释液（LRW），配制成1:19的比例（A），浓度为1,00,000欧姆/毫升（Eu/ml）。
5. 根据需要计算所需药液的体积。例如：加入0.2毫升的储备液（stock）和3.6毫升的稀释液（LRW），最终体积比为1:19，浓度为1,00,000欧姆/毫升（实际体积为3.8毫升）。
6. 根据标准操作规程（SOP），清洗18个18毫米长的检测管（10个/盒），用于细菌内毒素挑战试验。
向每个试管中加入100毫升（0.1毫升）来自试管（A）的内毒素指示剂。
8. 将试管在层流罩中放置过夜进行干燥。
9. 撕下足够的铝箔纸，将其对折后用来覆盖两个检测管。
10. 将含有内毒素挑战物的试管放入双层铝箔中。用铝箔将试管完全包裹起来，确保其完全被覆盖。
11. 对剩余的试管也执行相同的包装程序。
12. 保留两支试管作为阳性对照（不经过去热原处理）。将其标记为“PPC”（未经过验证的）。
13. 根据要求，将试管置于250°C的环境中，进行1小时的去热原处理，处理位置如下所示。
图：内毒素暴露的示意图位置
14. 将所有玻璃器皿装入烤箱中，进行常规的去热原处理循环。15. 现在根据标准操作规程（SOP）开始去热原处理流程。 **去热原处理** 玻璃器皿 在250°C下加热1小时。
16. 在去热原处理完成后，将试管转移到微生物实验室，并在室温下冷却。
17. 无菌地取下包裹好的铝箔，然后根据试管的摆放位置将它们放入试管架中。
18. 向每个备用的试管中加入1.0毫升的稀释缓冲液（LRW）。 **涡流；混乱状态** 持续15分钟。
19. 从每个样品管中取0.1毫升（100微升）样品，加入0.1毫升（100微升）裂解液，然后进行测试。
20 用于检测阳性对照品。
20.1 向无底试管中加入1.0毫升蒸馏水（LRW），然后涡旋混合15分钟。
20.2 按照下图所示的方法，从未标记的试管中配制一份1:10,000的稀释液。
0.1毫升（浓度为10,000 Eu/ml）+ 1.9毫升稀释液（LRW），混合比例为1:20，最终浓度为500 Eu/ml。
0.1 毫升（I）+ 1.9 毫升稀释液（LRW）= 1:400 的比例；（II）浓度为 25 毫克/毫升（25Eu/ml）
0.1 毫升（II）+ 2.4 毫升稀释液（LRW）= 1:10,000 的混合比例；（III）浓度为 1 欧姆/毫升（1Eu/ml）。
20.4 取44个去热原处理的试管，对试管进行编号并按照下表中的步骤进行操作。
试管编号
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要被标记为
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LRW（液体残留物）以毫升（ml）为单位
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1 欧姆/毫升（欧姆/毫升）
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样品体积（以毫升为单位）
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溶菌液（体积单位：毫升）
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1, 2,3, 4
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WNC
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100
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-
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-
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100
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5, 6, 7, 8
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WPC
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50
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50
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-
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100
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9, 10, 11, 12
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PPC
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-
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100
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-
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100
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13, 14, 15, 16
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PNC（地点1）
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-
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-
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100
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100
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17, 18, 19, 20
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PNC（地点2）
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-
|
-
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100
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100
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21, 22, 23, 24
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PNC（地点3）
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-
|
-
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100
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100
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25, 26, 27, 28
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PNC（位置4）
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-
|
-
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100
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100
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29, 30, 31, 32
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PNC（地点5）
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-
|
-
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100
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100
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33, 34, 35, 36
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PNC（位置6）
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-
|
-
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100
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100
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37, 38, 39, 40
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PNC（位置7）
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-
|
-
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100
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100
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41, 42, 43, 44
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PNC（位置8）
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-
|
-
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100
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100
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0.5 ml（III型试管，浓度为1 Eu/ml）+ 0.5 ml稀释液（LRW）= 0.5 Eu/ml （a）
(a) 0.5毫升 + (b) 0.5毫升稀释液 = 0.25欧姆/毫升
(b)中的0.5毫升 + (c)中的0.5毫升稀释液 = 0.125欧姆/毫升
0.5 ml 从 (c) 中取出 + 0.5 ml 标准稀释液（LRW）= 0.06 欧姆/毫升（Eu/ml）(d)
0.5 ml 从 (d) 中取出 + 0.5 ml 标准稀释液（LRW）= 0.03 欧姆/毫升（Eu/ml）(e)
0.5 ml 从 (d) 中取出 + 0.5 ml 标准稀释液（LRW）= 0.015 欧姆/毫升（f）
0.5毫升（来自（d））+ 0.5毫升空白溶剂（LRW）= 0.007欧姆/毫升（g）
21.1 取24个经过去热原处理的检测管，对每个管子进行编号并标记；将每组四个管子排列整齐，然后按照下表中的步骤进行操作。
样品
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使用了CSE稀释液。
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LRW
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溶菌液（体积单位：毫升）
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重复次数
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2升
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100毫升的2升溶液
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-
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100毫升
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4
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由于您提供的内容仅为“l”这一个字母，它没有明确的含义或翻译成中文的依据。请提供更多的上下文或信息，以便我能够为您提供准确的翻译。
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100毫升的l
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-
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100毫升
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4
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l/2
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100毫升的l/2
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-
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100毫升
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4
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l/4
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100米/升（或100毫升/升）
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-
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100毫升
|
4
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WNC
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-
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100毫升
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100毫升
|
4
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21.3 向每个试管中加入100毫升复溶后的裂解液，然后轻轻混合。
21.4 将反应混合物在37° ± 1°的温度下恒温孵育60 ± 2分钟，期间避免振动。
21.5 孵育结束后，取出每个试管，直接从培养箱中取出并一次性将其倒置约180°。如果形成了一个牢固的凝胶并且在倒置后仍然保持原位，则记录结果为阳性；如果没有形成完整的凝胶，则结果为阴性。
21.6 现在根据以下公式计算从阳性内毒素指示物对照品中回收的内毒素浓度：
内毒素浓度 = 溶液敏感性 × 重新配制后的体积 × 稀释倍数
最低限度；最小值 对数减少值（Log Reduction Value, LRV） 未加保护剂的对照瓶的内毒素浓度对数值减去加保护剂的对照瓶的内毒素浓度对数值。
8.0 接受标准
如果未暴露于测试物质（PPC）的试管中检测到的细菌内毒素回收量在标签声明浓度的两倍稀释范围内，则测试结果有效。2. 如果关键工艺参数（PPC）和水分含量（WPC）检测结果为阳性，而水分活性（WNC）和颗粒数（PNC）检测结果为阴性，并且经过连续三个周期的去热原处理后，试管中的细菌内毒素含量降低了3个对数单位以上，则该去热原处理循环被认为是有效的。