细菌生长的定量测定（总菌数与活菌计数）

除了了解样本中存在哪些类型的细菌外，还需要知道这些细菌的数量。食品制造商必须监测产品中细菌的类型和数量，以确保符合FDA的要求。在巴氏杀菌后，乳制品公司会检测牛奶中的细菌数量；在水处理厂中，他们会测量杀菌效果的有效性。

并非所有的食品和饮料都是无菌的；实际上，其中“无害”的细菌数量已经被大幅减少了。随着生物技术公司利用细菌来生产有用的药品，它们对这些微生物的生长进行了严格的控制。在酿酒过程中，酿酒厂也会密切监控酵母的生长情况。蒸馏工艺患者的抗菌敏感性是通过在实验室中测量细菌的生长率来确定的。有多种因素可以用来判断样本中细菌的数量。

对于总菌数计数

直接计数方法：可以通过在专用计数室载玻片上使用相位对比显微镜观察每个细胞来手动计数单个细胞。也可以使用诸如库尔特计数器（Coulter Counter）这样的机器来计算通过狭窄通道的细胞数量。这些方法得出的结果是细胞数（以毫升计）。尽管使用了相位对比技术，但这些方法仍存在一些挑战，例如细菌体积小且难以观察。细菌常常会聚集在一起。因此，实际细菌数量往往比报告的数量要高，因为聚集的细菌会被视为一个细菌。这些方法还包括统计样本中所有细菌的数量（无论它们是死是活）。整个计数过程只需要很短的时间。

**间接方法**：浊度也可以通过分光光度计进行定量测量，或者使用 McFarland 标准进行定性分析，从而确定细菌的总数量。以下是使用分光光度计测量细菌数量的步骤。为了标准化抗菌药物敏感性测试，我们将采用 McFarland 标准。当样本中的细菌数量增加时，样本的浊度也会增加。浊度可以用来估计处于指数增长（对数增长）阶段的培养物中存活的细胞数量。然而，在迟滞期，培养物中的死细胞和活细胞都会导致总计数超过存活细胞的数量。

活菌计数

通常需要测定样品中活细菌的数量，以评估生长速率或消毒剂的效果。细菌样品会被依次稀释，然后接种到适当的培养基上。或者，也可以将膜放置在浸有培养基的垫子上，再将样品通过该膜过滤。培养板培养18-24小时后，细菌菌落就会显现出来。只要观察到的菌落是由一个活细菌单元产生的，就可以认为这些菌落都来源于这个单元。实际上，细菌通常不是以单个形式存在的，因此你看到的一个菌落可能来源于一个细胞或一组细胞。结果报告通常使用“CFU”（菌落形成单位）来表示。

平板计数法

有多种常用的方法用于计算平板上的细菌数量，包括倾注平板法、覆盖平板法和表面计数法。在这些方法中，细菌样本被悬浮在适当温度下的熔融琼脂中，以防止其凝固。随后，将一层薄薄的琼脂液覆盖在另一层琼脂表面或倒入空培养皿中。通过这些方法可以形成较小且紧密的菌落。由于菌落之间不会相互接触，因此可以更有效地计算平板上的细菌数量。

一个缺点是：在倾倒培养基之前，需要将琼脂加热到适当的温度以防止其凝固，同时又必须确保其温度足够低以避免对细菌造成热冲击或杀死细菌，这确实相当困难！表面计数平板能够提供一致、可靠的结果。微生物学专业的学生会特别喜欢这种操作方式的便捷性——因为细菌可以通过移液器均匀地分布在平板表面。此外，如果你使用的是选择性培养基，这种方法会更加实用，因为不同细菌对氧气的需求不同，导致它们在琼脂中的生长会呈现出不同的颜色变化。不过，任何出现明显浑浊的细菌培养物在开始实验之前都需要先进行稀释处理。

随着细菌的生长，它们会被接种到液体培养基或固体培养基中，并定期对其数量进行计数。
有多种方法可以用来测量微生物种群的增长。在一些方法中，是通过测量细胞的数量来评估种群规模的；而在另一些方法中，则是通过测量微生物的质量来进行的，这种质量通常与细胞的数量直接相关。
细胞的数量会逐渐增加。
通过二分裂或出芽方式繁殖的微生物也能产生大量的新细胞。

测量微生物的生长

可以使用多种方法来测量微生物的生长，以确定其生长速率和世代时间。
生长的程度可以通过测量质量或数量来确定；由于生长，这两者都会增加。
有多种不同的方法可以用来测量生长情况：

在这种方法中，生长的情况可以通过电子颗粒计数器或显微镜直接测量，或者通过菌落计数间接测量。
在这种生长过程中，细胞质量可以通过分析天平直接测量，或者通过测量细胞中的氮浓度，或者利用分光光度计测定浊度来间接测量。
通过分析生化活性与细胞数量之间的关系，可以衡量这种生长过程中细胞的活跃程度。

每种测量方法都将通过具体的操作程序来进行说明。

直接显微镜计数

直接计数微生物是最直接的方法。
使用Petroff-Hausser方法计数细菌是最简单且最准确的方法。
在腔室的侧视图中，可以看到盖玻片下方以及盖玻片与盖子之间的空间，那里存放着细菌悬浮液。
从顶部看这个腔室，其中心装有一个网格。
这是放大后的网格视图。在几个中央方格中，细菌的数量是通过400到500倍的放大倍数进行计数的。
可以通过计算每个方格内的细菌数量平均值来计算细胞浓度。
该培养箱内有25个正方形区域，每个区域的面积为1平方毫米。将1平方毫米内的细菌数量除以正方形的数量（25个），就可以得到每立方毫米内的细菌数量。假设培养箱的深度为0.02毫米，那么25个正方形区域所占据的体积为25×0.02=0.5平方毫米，因此每立方毫米内的细菌数量等于25个正方形区域的数量（即50个）。

电子细胞计数

微生物的生长是通过将细菌通过直径为10到30微米的微小孔洞来测量的，这一过程是在电子颗粒计数器中完成的。
计数器的两个腔室通过一个含有导电溶液的孔道相连。
当细菌通过孔口时，两个隔室之间的电阻会短暂增加。每当有细菌通过时，系统会生成一个信号并自动进行计数。
这种方法的主要缺点是无法确定所计数的细胞是否具有活性（即是否能够存活）。

平板计数法

在某些特定的条件下，可以通过这种方法确定增殖的细胞数量。
为了进行平板计数，有两种不同的方法：一种是涂布平板法，另一种是倾注平板法。
在估算细菌数量时，这种计数方法最常用于牛奶、水、食品以及许多其他材料中。
这种技术的一个缺点是，一些对热敏感的微生物可能会被融化的琼脂破坏，因此在琼脂冷却后无法再次生长繁殖。

细菌数量的浊度估计

在监测细菌生长时，浊度是唯一可行的方法。
测量细菌生长的方法：微生物在液体培养基中繁殖，导致培养基因细胞生长而变得浑浊。
通常，浊度指的是介质或流体因含有大量颗粒而呈现的浑浊或模糊状态。
分光光度计（或比色计）是用于测量浊度的仪器。
光吸收的量可以用来确定微生物的数量（或质量）。
分光光度计将一束光照射到细菌悬浮液中；当细菌数量增加时，透过悬浮液的光强度也会增强。
随着细胞数量的增加，细胞吸收的光线量也随之增加，从而导致浊度上升。可以使用分光光度计这种仪器来测量浊度。
细菌的生长情况可以通过吸光度来绘制图表进行表示。

氮含量的测定

细胞物质主要由蛋白质组成，而氮是蛋白质的典型成分。
我们描述细菌群体或细胞培养物的能力，可以通过测量细菌中的氮含量来确定。
首先，收集细胞并清洗掉培养基，然后通过定量化学分析来确定细胞中的氮含量。

干重细胞的测定

典型的测量方法对于丝状细菌和霉菌来说可靠性较低。平板计数法无法区分丝状生长和非丝状生长。
在放线菌和霉菌中，通常计数的是无性孢子而不是有性孢子。
用这种方式无法准确测量生长情况。干重是确定丝状生物生长情况的更准确方法。
该过程包括从培养基中去除真菌，使用过滤器去除杂质，然后在干燥器中将其干燥。
通过从发酵液中取出已知体积的培养物样本或对其进行离心处理，可以很容易地检测到微生物的生长情况。
这是定量测量细胞质量最方便的方法。

通过过滤法计数细菌

过滤方法常用于检测湖泊或溪流中细菌数量较少的样本。
在这个过程中，100毫升的水通过一个具有非常细小孔隙的薄膜过滤器，这些孔隙能够阻止细菌通过。
过滤过程完成后，水中的细菌被去除，但会残留在过滤器的表面。接着，将含有液体营养培养基的培养皿放置在过滤器表面，细菌菌落就会在那里生长起来。
大肠杆菌是衡量食品和水中粪便污染程度的指标，这种方法常被用来检测和计数大肠杆菌的数量。

最可能数（MPN）法

MPN（最可能数）是另一种用于测定样品中细菌数量的方法。
统计估计技术基于这样一个原理：样本中含有的细菌数量越多，就需要进行更多的稀释，才能将细菌数量降低到稀释后试管中不再含有细菌的程度。
如果用于计数的微生物不适合在固体培养基上生长（例如化能自养硝化细菌），那么MPN方法就非常有用。
使用细菌的生长（例如，能够发酵乳糖的大肠菌群）也有助于在液体鉴别培养基中识别微生物。
MPN（微生物计数）只是一个声明，表示细菌数量有95%的概率落在某个特定范围内，并且这个范围代表了最可能的情况。