细菌内毒素检测的标准操作规程（SOP）

5.1 一般要求

5.1.1 按照要求清洁所有玻璃器皿，并对其进行去热原处理。 去热原化标准操作规程 用于 BET（比表面积测定）的玻璃器皿。
5.1.2 将所有内容转移至 无热原 将玻璃器皿移至BET实验室。
5.1.3 按照操作说明书（SOP）的要求，将加热块“打开”（Switch “ON”）。 加热块 并将温度设定为37°C。
5.1.4 使用以下公式计算样品的 MVD（平均变异度）：
5.1.5 用稀释缓冲液（LRW）将待测试样品稀释至其四分之一的最小检测浓度（MVD），然后在涡旋振荡器上振荡3分钟。
5.1.6 注射用水的取样与检测：收集 注射用水 根据采样计划，使用去热原处理过的小瓶或试管进行样品采集。注射用水的检测应按照相关标准进行。 分析方法.

5.2 对照品（CSE）的制备

5.2.1 按照制造商在瓶子和随附证书中提供的说明，使用稀释液（LRW）重新配制CSE（化合物），并间歇性地进行30分钟的涡旋混合。
5.2.2 使用复溶后的溶液 CSE 在复溶后的4周内。
5.2.3 用实验室用水（LRW）配制一份浓度为1 EU/ml的稀释液，并在涡旋混合器中振荡该稀释液3分钟。
5.2.4 准备4λ浓度溶液：将1 EU/ml的溶液稀释至所需体积，使其浓度达到4λ。使用涡旋振荡器将稀释后的溶液振荡3分钟。4λ的最终浓度需要根据l浓度进行反算（其中λ表示裂解液的灵敏度）。

5.3 溶液的复溶

5.3.1 现在，使用无菌刀片打开裂解液的铝封，然后重新配制裂解液。
5.3.2 将裂解液粉末轻轻敲击在硬表面上，使其收集到小瓶的底部。然后缓慢打开瓶塞。
5.3.3 按照制造商的指示，添加稀释液（LRW）或 缓冲溶液 在使用前请检查，并立即更换软木塞。

5.4 标记裂解物敏感性的确认

5.4.1 在使用前，需通过四次重复实验确认裂解液溶液的灵敏度值（标记为 λ，单位为 EU/ml 或 IU/ml）。当使用新的裂解液批次，或者实验条件发生可能影响测试结果的变化时，必须重新确认裂解液的灵敏度。
5.4.2 从浓度为 4λ 的溶液中制备 CSE 稀释液，至少包括四个浓度：2λ、0.5λ 和 0.25λ。具体方法是将 CSE 溶液用水（BET（LRW））进行系列稀释。
5.4.3 取10个经过去热原处理的检测管，对每个管子进行编号并标记；将这10个管子每4个一组排列在支架上；然后按照下表中的步骤进行操作。
5.4.4 用移液器分别将100毫升稀释后的CSE溶液移至去热原处理的试管（尺寸为10毫米×75毫米）中，分别配制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ的浓度，并进行相应的标记。对于NWC（阴性水对照），使用100毫升的LRW（实验室用水）进行重复四次（四重复）的实验。
5.4.5 向每个试管中加入100毫升复溶后的裂解液，然后轻轻混合。
5.4.6 将反应混合物在37° ± 1°的温度下恒温孵育60 ± 2分钟，期间避免振动。
5.4.7 孵育结束后，取出每个试管，直接从培养箱中取出并一次性将其倒置约180°。如果形成了一个牢固的凝胶并且在倒置后仍然保持原位，则记录结果为阳性；如果没有形成完整的凝胶，则结果为阴性。
5.4.8 除非标准溶液的最低浓度在所有重复试验中均显示阴性结果，否则该测试无效。
5.4.9 终点是指在内毒素浓度逐渐降低的系列检测中得到的最后一个阳性结果。计算这些终点浓度的对数值的平均值，然后使用以下公式计算该平均值的反对数：
5.4.10 几何平均终点浓度是指测量得到的数值。 裂解液溶液的灵敏度 （EU/ml 或 IU/ml）。如果该值不小于 0.5λ 且不大于 2λ，则确认了标签上标注的灵敏度，并可使用该裂解物进行后续的检测。

5.5 测试程序

5.5.1 按照表1中的说明，配制溶液A、B、C和D。
表1
5.5.2 取8个经过去热原处理的试验管，对每个管子进行编号并排列，使相邻的管子成对：1号和2号用于NPC（非蛋白结合化合物），3号和4号用于PPC（蛋白结合化合物），5号和6号用于PWC（多糖结合化合物），7号和8号用于阴性水对照。
5.5.3 在NPC和PWC中各加入50毫升LRW（缓冲液），在NWC中加入100毫升LRW。立即加入50毫升产品样品（该样品已在NPC和PPC中稀释至MVD/4的浓度），随后在NPC和PWC中各加入50毫升CSE（稀释至4λ的浓度）。
5.5.4 最后，在所有试管中加入100毫升裂解液，然后手动混合这些试管，并将它们放入加热块中孵育。加热块的温度应保持在37 ± 1°C，孵育时间为60 ± 2分钟。

5.6 结果的解释

5.6.1 在凝胶凝块法中，每个试管的结果被判定为阳性或阴性。阳性结果表示形成了坚固的凝胶，这种凝胶在试管倒置180°后仍能保持其完整性。
5.6.2 阴性测试的结果表现为没有凝胶形成，或者形成了一个粘性物质，但当试管被倒置180°时，这种粘性物质会散开。
5.6.3 该测试结果无效，除非两个阳性对照溶液B和C的两个重复检测结果均为阳性，而阴性对照溶液D的检测结果均为阴性。
5.6.4 当溶液A的两个重复检测结果均为阴性时，所检测的制剂符合测试要求。
5.6.5 如果溶液A的两个重复检测结果均为阳性，则该溶液不符合测试要求。
5.6.6 如果溶液A的一个重复检测结果为阳性，而另一个重复检测结果为阴性，则需要重新进行测试。如果在重新测试中，溶液A的两个重复检测结果均为阴性，则所检测的制剂符合该测试要求。

5.7 故障调查

5.7.1 当测试制备的两个试管均显示阳性结果时，应通过检查以下参数来调查其失败的原因。
5.7.2 检查产品稀释液、细胞悬浮液（CSE）稀释液以及裂解物稀释液的浓度。
5.7.3 是否按照规定对玻璃器皿进行了清洗和脱氢处理 玻璃器皿清洗标准操作规程.
5.7.4 检查裂解物批次（Lysate lot）及其匹配的对照样品（CSE）的灵敏度报告。
5.7.5 检查加热块的温度并进行校准。
5.7.6 检查 微量移液器校准.
5.7.7 检查任何来源的…… 污染；杂质 由于微生物学家的原因而发生。

5.8 注意事项

5.8.1 重新水化的CSE可以在2至8°C的温度下储存28天。
5.8.2 提供的检验报告书（COA）是针对特定裂解物批次（lysate lot）和细胞悬浮液批次（CSE lot）的。因此，请使用相同的批次进行检测。
5.8.3 不要使用涡旋方式裂解细胞液。

5.9 频率

5.9.1 溶液敏感性确认 – 每批货物均需进行确认。
5.9.2 按照注射用水的取样计划执行。
5.9.3 成品和原料药的批次管理。

6.0 缩写词

标准操作规程（SOP）
QA：质量保证
QC：质量控制
NA: 不适用
BET：细菌内毒素检测
CSE：内毒素控制标准
MVD：最大有效稀释度
LRW：Lal试剂用水
PPC：阳性产品对照品
NPC：不合格产品控制
PWC：阳性水对照
NWC：阴性水对照