1.0 目标
制定程序的目的是为生物指示物的确认提供指导。2.0 范围
该程序适用于生物指示物的确认，即地衣芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus，ATCC 7953）和枯草芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus，即Bacillus subtilis，ATCC 9372），这些指示菌用于高压灭菌过程。 隧道验证（Tunnel Validation）.3.0 责任
微生物学家4.0 责任制
质量保证与质量控制部门负责人5.0 程序
5.1 生物指示菌培养物的鉴定试验
5.1.1 显微镜检查 – 取出一条试纸条或一支安瓿，进行显微镜检查。 生物指示剂 将悬浮液置于10毫升的无菌生理盐水中。轻轻摇晃悬浮液，然后取一滴悬浮液滴在玻璃载玻片上，并进行相应的操作。 革兰氏染色 在显微镜下观察该切片。末端细胞膨胀、含有椭圆形内孢子的革兰氏阳性杆菌，可以确定为嗜热脂肪地杆菌（Geobacillus stearothermophilus）。而萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）也是革兰氏阳性杆菌，呈杆状，具有椭圆形内孢子，但其细胞并未膨胀。5.1.2 生长特性
5.1.2.1 将一条生物指示剂试纸（一个安瓿）悬浮在10毫升的营养肉汤中，然后在37ºC下培养48小时。从试管中取出一环培养物，分别涂布在两个含有大豆酪蛋白消化琼脂培养基的培养皿上。其中一个培养皿在30ºC至35ºC下培养24小时，另一个在55ºC至60ºC下培养24小时。5.1.2.2 如果在55ºC至60ºC下培养的平板上出现微生物生长的迹象，而30ºC至35ºC下培养的平板上没有微生物生长的迹象，则可以确定该菌为Geobacillus stearothermophilus。
5.1.2.3 如果在30ºC至35ºC下培养的平板出现微生物生长的迹象，而在55ºC至60ºC下培养的平板没有出现任何微生物生长的迹象，则可以确定该菌为Bacillus atrophaeus。
5.2 生物指示剂中的总活孢子计数
5.2.1 从其原始单独容器中随机选取四条生物指示剂的孢子条。5.2.2 将每条孢子条放入一个无菌的、带螺旋盖的平底试管中，试管内应含有三颗6毫米的玻璃珠以及5.0毫升的……（此处内容缺失，无法完整翻译）。 无菌纯化水.
5.2.3 以涡流方式搅拌4至7分钟，直至纸载体被充分浸湿并变成纸浆状。
5.2.4 加入5.0毫升无菌纯化水，然后再次涡旋混合。
5.2.5 将1毫升的悬浮液转移到含有9毫升无菌纯化水的试管中，并进行涡旋混合。
5.2.6 将稀释管放入预热至95ºC至100ºC的浴槽中加热15±1分钟（用于Geobacillus stearothermophilus），或放入预热至80ºC至85ºC的浴槽中加热10分钟（用于Bacillus atrophaeus）。
5.2.7 取出试管，并在冰浴（0ºC – 4ºC）中迅速冷却。
5.2.8 将每个经过热处理的试管剧烈涡旋至少十秒钟。然后对这些试管进行系列稀释，以获得30到300个菌落。对于每个稀释后的试管，同样需要剧烈涡旋至少十秒钟。
5.2.9 为每个样品分液制备单独的培养皿系列。将每种选定稀释液各1.0毫升分别加入两个培养皿中。
5.2.10 将约20毫升冷却至45º至50ºC的熔融大豆酪蛋白消化琼脂倒入培养皿中。轻轻旋转培养皿以确保充分混合，然后让琼脂固化。
5.2.11 将含有 Geobacillus stearothermophilus 的平板在 55º–60ºC 下倒置培养，含有 Bacillus atrophaeus 的平板在 30º–35ºC 下培养 48 至 72 小时。在 55º–60ºC 下培养的平板可以放在塑料袋中，以防止其过度干燥。
5.2.12 孵育后，计数菌落形成单位（CFU）。
5.2.13 计算平均菌落数，然后乘以稀释因子，以得出每个原始单位中的菌群数量。
5.2.14 记录所有关于生物指示物数量测定记录的信息。
5.2.15 对于生物指示剂，使用密封的安瓿瓶，取4个安瓿放入一个无菌的250毫升锥形瓶中，通过将安瓿瓶在瓶壁上摇晃来打破它们。加入足够的无菌纯化水至100毫升，然后剧烈涡旋或超声处理以获得均匀的悬浮液。将10毫升悬浮液转移到一个无菌的螺旋盖试管中，按照上述步骤进行操作。
5.3 孢子存活时间与杀灭时间测试
关于嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）5.3.1 对于生存时间的检测，将一个生物指示剂放入合适的容器中（例如培养皿的盖子），然后将其放置在之前已经……（The text seems incomplete here; the translation should be continued based on the full context.) 经过验证的高压灭菌器不要盖上盖子，以便让生物指示剂完全暴露在蒸汽中。然后运行（相关设备或程序）。 蒸汽灭菌循环 根据生物指示物的检验报告书（COA），在121°C（±0.5ºC）的温度下进行至少规定的存活时间测试。立即将生物指示物从高压灭菌器中取出，并将其无菌转移到无菌的SCDM培养基中，然后在55°C至60°C的温度下培养7天。
5.3.2 为了确定杀菌时间，将一个生物指示剂放入合适的容器中（例如培养皿的盖子内），然后将其放入已经过验证的高压灭菌器中。不要盖上培养皿的盖子，以确保生物指示剂能够充分暴露在蒸汽中。按照生物指示剂的检验报告要求，在121°C（±0.5ºC）下进行蒸汽灭菌处理，直至达到规定的杀菌时间。灭菌完成后，立即将生物指示剂从高压灭菌器中取出，并将其转移到无菌的SCDM培养基中，然后在55°C至60°C的温度下培养7天。
5.3.3 同时使用阳性对照和阴性对照。
5.3.4 在存活时间测试中应观察到阳性对照组的明显生长现象；在杀灭时间测试中，阳性对照组和阴性对照组均不应出现生长。
对于枯草芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）
5.3.5 对于生存时间测试，将一个生物指示剂放入合适的容器中（例如培养皿的盖子内），然后将该容器放入已经过确认的干燥箱（DHS）中。不要盖上培养皿的盖子，以确保生物指示剂能够完全暴露在干燥环境中。接着进行实验操作。 DHS cycle 根据生物指示物的检验报告书（COA），在160°C（±1ºC）的温度下进行至少规定时间的培养以确定其存活率。立即将生物指示物从DHS中取出，然后无菌转移到无菌的SCDM中，并在30°C至35°C的温度下培养7天。
5.3.6 为了测定杀菌时间，将一个生物指示剂放入合适的容器中（例如培养皿的盖子），然后将该容器放入之前已经……（The text seems incomplete here; the translation should be continued based on the full context.) 合格的DHS不要关闭培养皿，以确保生物指示剂完全暴露在干热环境中。根据生物指示剂的检验报告书（COA），在160°C（±1ºC）下进行DHS循环，以达到最低杀灭时间。立即将生物指示剂从DHS中取出，并无菌转移到无菌的SCDM中，然后在30°C至35°C的温度下培养7天。
5.3.7 同时使用阳性对照和阴性对照。
5.3.8 在存活时间测试中应观察到阳性对照组的明显生长现象；在杀灭时间测试中，阳性对照组和阴性对照组均不应出现生长。
5.4 注意事项
5.4.1 不得使用已经熔化并保存超过8小时的琼脂。5.4.2 为了避免平板计数结果不准确，使用内径较大的移液器（如2.0毫升移液器）进行连续转移操作非常重要。这样可以防止棉纤维堵塞移液器尖端。
5.5 限度/验收标准
如果每个载体上的活孢子的对数平均值不低于0.3，并且总活孢子数与每个载体上标注的孢子数量的对数之差不超过0.48，则该测试要求得到满足。相关： 新一代基因工程生物指示剂
6.0 缩写词
标准操作规程（SOP）QA：质量保证
QC：质量控制
NA: 不适用
SCDA：大豆酪蛋白消化琼脂
IPA：异丙醇
CFU：菌落形成单位