1.0 目的
制定使用标准培养方法进行抗菌有效性测试的程序。2.0 范围
该规定适用于抗菌效果测试的微生物实验室。3.0 责任
微生物学专业人员4.0 责任制
部门主管5.0 程序/规程
5.1 在抗菌有效性测试过程中已采取预防措施。
5.1.1 所使用的玻璃器皿必须经过灭菌处理。5.1.2 所使用的培养基应预先进行培养（即预先进行培养处理）。
5.1.3 使用的标准培养物不得超过4代。
5.2 使用的测试菌株
使用以下微生物的培养物：白色念珠菌（Candida albicans）ATCC No. 10231、黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC No. 16404、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC No. 8739、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC No. 9027以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC No. 6538。
用于测试的活微生物必须是从原始的 ATCC 文库或其他等效文库中分离出来的，且分离次数不得超过五次。
用于测试的活微生物必须是从原始的 ATCC 文库或其他等效文库中分离出来的，且分离次数不得超过五次。
5.3 接种液的制备
5.3.1 按照以下要求制备接种物： 培养液制备的标准操作规程（SOP）.
5.3.2 为了收集细菌和白色念珠菌（Candida albicans）的培养物，需要使用无菌蛋白胨盐水溶液。先清洗培养物表面的生长物，然后将其收集到合适的容器中。 玻璃器皿添加足够的（成分或资源等） 无菌的 使用蛋白胨盐水培养基，以获得约1 × 10^6的微生物计数。8 每毫升中的菌落形成单位（CFU）。为了收集黑曲霉（Aspergillus niger）的细胞，使用含有0.05%聚山梨酯80的无菌蛋白胨盐水，并加入足够量的无菌蛋白胨盐水，以获得约1 × 10^6 CFU的细胞计数。8 每毫升中的菌落形成单位（CFU）
5.3.3 根据下表中列出的培养基条件和微生物恢复培养时间，确定每种悬浮液每毫升中的菌落形成单位（CFU）数量，以确认测试中使用的接种物浓度。该数值用于校准测试中使用的接种物量。细菌和酵母悬浮液应在收获后24小时内使用，而真菌制剂可在冷藏条件下保存最多7天。
5.3.4 根据下表所示的培养条件进行接种物制备：
微生物；生物体
|
适用介质
|
培养；孵育；潜伏期
温度 |
培养时间
|
微生物回收率
培养时间 |
大肠杆菌
|
SCM / SCA
|
32.5 ± 2.5°C
|
18到24小时
|
3到5天
|
铜绿假单胞菌
|
SCM / SCA
|
32.5 ± 2.5°C
|
18到24小时
|
3到5天
|
金黄色葡萄球菌
|
SCM / SCA
|
32.5 ± 2.5°C
|
18到24小时
|
3到5天
|
白色念珠菌
|
SCM / SDA
|
22.5 ± 2.5°C
|
44到52小时
|
3到5天
|
黑曲霉（Aspergillus niger）
|
SCM / SDA
|
22.5 ± 2.5°C
|
6到10天
|
3到7天
|
5.4 测试程序
5.4.1 如果每个容器中有足够的产品体积，该测试可以在五个原始容器中进行；或者，也可以使用五个大小合适的无菌带盖细菌培养容器进行测试，这些容器中已转移了足够体积（不少于）的产品。5.4.2 向每个容器中接种一种已制备并标准化的接种物，然后混合。接种物的体积为…… 悬浮接种物 所使用的成分占产品体积的0.5%到1.0%之间。
5.4.3 加入产品中的测试微生物的浓度应确保接种后的最终测试制剂浓度在 1 × 10^6 至 1 × 10^8 个微生物/毫升之间。5 1 × 106 每毫升产品中的菌落形成单位（CFU）。
5.4.4 每个测试样品中活微生物的初始浓度是根据标准接种物中的微生物浓度估算的，该浓度是通过平板计数法确定的。5.4.5 将接种后的容器置于 22.5 ± 2.5°C 的温度下培养。按照第 5.5 条中规定的时间间隔对每个容器进行取样。记录这些时间间隔内观察到的任何外观变化。
5.4.6 通过平板计数法确定每个测试样品中在相应时间间隔内的菌落形成单位（CFU）数量。
5.4.7 在平板计数中加入特定抗菌剂的灭活剂（中和剂），或者在制备用于接种的适当稀释液中加入灭活剂（如需要）。
5.4.8 使用测试开始时测得的每毫升培养基中的CFU（菌落形成单位）浓度，计算每个微生物在相应测试时间点每毫升培养基中CFU浓度的对数（log10）变化值，并将这些变化表示为对数的减少量。
相关： 用于培养真菌和细菌的常见培养基的孵育条件
5.5 频率与验收标准
根据欧洲药典（EP）的规定：
产品类别
|
案例；例子
|
细菌对数减少
|
真菌对数减少值
|
|||||||
6小时
|
24小时
|
两天
|
第七天
|
第14天
|
第28天
|
第七天
|
第14天
|
第28天
|
||
注射剂和眼科制剂
|
A
|
2
|
3
|
-
|
-
|
-
|
NR
|
2
|
-
|
NI
|
B
|
-
|
1
|
-
|
3
|
-
|
NI
|
-
|
1
|
NI
|
|
局部用制剂
|
A
|
-
|
-
|
2
|
3
|
-
|
NI
|
-
|
2
|
NI
|
B
|
-
|
-
|
-
|
-
|
3
|
NI
|
-
|
1
|
NI
|
|
口服制剂
|
A
|
-
|
-
|
-
|
-
|
3
|
NI
|
-
|
1
|
NI
|
根据《美国药典》（USP）的规定：
类别
|
细菌
|
酵母和霉菌
|
注射剂、其他无菌制剂（包括乳剂）、耳用产品、无菌鼻用产品以及以水基或溶剂为基础的眼用产品。
|
在7天内，微生物数量应至少减少1.0个对数单位（log reduction）；在14天内，微生物数量应至少减少3.0个对数单位；在28天内，微生物数量不应比14天时的数量有所增加。
|
在7天、14天和28天时，数量均未超过最初计算出的数值。
|
局部使用的制剂，这些制剂以水基或溶剂为基础制成，属于非无菌鼻用产品或乳剂，包括那些应用于黏膜的产品。
|
在14天后，微生物数量必须减少至少2.0个对数单位（log reduction）；并且在28天后，微生物数量不得超过14天时的水平。
|
在14天和28天时，数量均未超过最初计算出的数值。
|
除抗酸药以外的口服制剂，这些制剂使用水基或溶剂作为载体进行制备。
|
在14天后，微生物数量必须减少至少1.0个对数单位（log reduction）；并且在28天时，微生物数量不得超过14天时的水平。
|
在14天和28天时，数量均未超过最初计算出的数值。
|
以水基为原料制成的抗酸药
|
在14天和28天时，数量均未超过最初计算出的数值。
|
|
根据协调一致的标准：
产品类别
|
案例；例子
|
细菌对数减少
|
真菌对数减少值
|
|||||||
6小时
|
24小时
|
两天
|
第七天
|
第14天
|
第28天
|
第七天
|
第14天
|
第28天
|
||
注射剂和眼科制剂
|
A
|
2
|
3
|
-
|
NI
|
NI
|
NR
|
2
|
NI
|
NI
|
B
|
-
|
1
|
-
|
3
|
NI
|
NI
|
NI
|
1
|
NI
|
|
局部用制剂
|
A
|
-
|
-
|
2
|
3
|
NI
|
NI
|
-
|
2
|
NI
|
B
|
-
|
-
|
-
|
-
|
3
|
NI
|
-
|
1
|
NI
|
|
口服制剂
|
A
|
-
|
-
|
-
|
-
|
3
|
NI
|
-
|
1
|
NI
|
抗酸药
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
NI
|
NI
|
-
|
NI
|
NI
|
6.0 缩写词
6.1 标准操作规程（Standard Operating Procedure）6.2 ATCC - 美国典型培养物保藏中心（American Type of Culture Collection）
6.3 CFU - 菌落形成单位
6.4 SCM - 大豆酪蛋白消化培养基
6.5 SCA - 大豆酪蛋白消化琼脂
6.6 SDA - 萨伯劳德葡萄糖琼脂（Sabouraud Dextrose Agar）
6.7 °C - 摄氏度
6.8% - 百分比
6.9 EP - 欧洲药典
6.10 USP - 美国药典