库存菌种维护与转移的标准操作规程

1.0 目标

为了维持和转移库存菌种/细胞株。

2.0 范围

为了控制用于微生物检测的细菌培养物，必须采取相应的管理措施。

3.0 责任

3.1 职位：技术助理（微生物学家）/ 经理
3.2 检查：执行人员/经理

4.0 责任追究

部门负责人

5.0 程序

5.1 媒介要求：

**大豆酪蛋白消化琼脂**
2. 大豆酪蛋白消化肉汤
3. 萨博劳德葡萄糖琼脂（Sabouraud dextrose agar）
4. 马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar）
5. 马铃薯葡萄糖培养基
6. 流动硫代葡萄糖酸盐培养基
7. 厌氧琼脂
大肠杆菌突变体琼脂培养基（维持培养基）
9. 泛酸钙接种液
10. 泛酸钙培养基琼脂
11. GYE agar
12. L. leichhmani 接种液
13. L. Leichhmani 培养基琼脂

5.2 材料要求

a. 无菌眼罩
b. 剪刀
c. 燃烧器
d. 1毫升和2毫升的冻存管
e. 20%无菌甘油
f. 无菌水
g. 无菌微针头
h. H1厌氧系统标记
i. 厌氧气体包装
j. 无菌生理盐水
0.9%生理盐水 + 0.5%吐温80
深冻柜
m. Roux bottles
5.3 在收到 ATCC/MTCC/NCTC 的菌种标签后，应对其进行标记并记录在案。
5.4 为了降低产生突变体的风险，该通道的长度不应超过5米。所有操作都应在生物安全柜内进行，以尽量减少风险。 污染；杂质.
5.5 ATCC/MTCC/NCTC菌株对液体培养基和固体培养基的时间及温度要求如下：
用1毫升无菌蒸馏水复溶粉末，涡旋混合1分钟后充分搅拌均匀。
b. 在相应的液体培养基中分别加入0.25毫升的样品，重复两次（即每组两个样品）。
注意：将 A. niger 播种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，并将培养皿装入无菌袋中。
c. 按照上述时间表和温度要求进行培养（或孵育）。

5.7 发芽微生物的处理程序
5.7.1 发孢微生物如下：
a. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
b. 棒状孢子菌
5.7.2 对于枯草芽孢杆菌（B.subtilis）
1. 在液体培养基中培养冻干后的孢子。
2. 为2个装有GYE琼脂的培养瓶准备两个 roux 溶液瓶。
3. 将每个烧瓶中的培养物接种到 roux 瓶中，并借助无菌玻璃珠将其均匀分散开来。
在37摄氏度下培养5至7天。
5. 使用无菌生理盐水收集菌落，并在70摄氏度下进行2到3次热休克处理，每次处理时间为半小时，以杀死营养细胞。
6. 与等体积的20%甘油混合后，灌装到冷冻小瓶中。
将小瓶储存在-20°C的深冻柜中。
5.7.3 对于孢子形成的菌类（Cl. sporogenous）
将冻干后的培养物接种到含有硫代葡萄糖酸盐的液体培养基中，并在厌氧条件下进行培养。
2. 准备两个装有2升液体的烧瓶，并分别加入适量的黄油和面粉，搅拌制成面糊（roux）。
3. 将每个烧瓶中的培养物接种到 roux 瓶中，并借助无菌玻璃珠将其均匀分散开来。
在37摄氏度下进行厌氧培养，培养时间为5至7天。
5. 使用无菌生理盐水收集菌落，并在70°C下进行2到3次热休克处理，每次处理时间为半小时，以杀死营养细胞。
6. 与等体积的20%甘油混合后，灌装到冷冻小瓶中。
将小瓶储存在-20°C的深冻柜中。
5.7.4 在冻干粉复溶后，按照以下步骤操作。
从两个烧瓶中各取0.1毫升液体，加入到两个9.0毫升的SCD试管中，用于存活率和计数测试。
将0.2毫升的20%无菌甘油加入两个各含有0.2毫升无菌甘油的冻存管中，然后将其置于-20摄氏度的环境中保存。
将冷冻管上的标签主培养物代码 M2 和 M3 标记为主培养物。
3. 在25毫升的Fluid SCD培养基中分别加入0.25毫升的样品，然后按照上述时间和温度要求进行培养，最终将培养后的样品分装到冻存管中。
5.8 其他微生物在冷冻小瓶中的分布情况
1. 在生物安全柜中培养两个25毫升的烧瓶后，从每个烧瓶中取出1.0毫升样品，然后加入9毫升无菌生理盐水，用于计数活菌数量。
2. 对于 A.niger（一种微生物），使用含有 0.9% NaCl 和 0.5% 聚山梨酯 80 的培养基来收集其孢子。
3. 在每个含有生长物的培养瓶中，缓慢加入等体积的无菌20%甘油，并充分混合均匀。
将1.5毫升的样品分装到50个冷冻管中，每支冷冻管的标签上标注相应的传代代码，从SC-1到SC-50。
培养物名称：
ATCC/MTCC/NCTC 编号：
日期：
段落编号：
传代次数：
5.8.1 将样品放入低温箱中，并存放在–20°C的深冻环境中；同时，必须正确标记低温箱。
5.8.2 记录冻存管制备的复溶过程。
5.8.3 每十五天取出每个培养物的一份冻存管（cryovial），首先在液体培养基中进行第一次活化处理，然后在斜面培养基上进行第二次活化处理。记录取出的日期以及斜面培养基上活化的日期。

5.9 活菌计数

在冻干培养物重新溶解后，对每种培养物进行活菌计数，即初始的 ATCC 培养物计数。
b. 在液体培养基中培养24小时后，进行保存培养计数。
c. 将样品在–20°C的深冻柜中冷冻24小时后，检测其存活率以及对培养物的影响。
d. 通过向9毫升无菌生理盐水中加入1毫升溶液，进行多次系列稀释。
注意：对于 A.niger，使用 0.9% 的无菌生理盐水和 0.5% 的吐温 80 混合物。
e. 对所有稀释液进行平板计数，每个稀释液取1毫升样品，每个平板重复操作两次（即每个稀释液在两个不同的平板上进行计数）。
f. 根据培养要求，在适当的温度和时间下进行培养。当培养皿上出现可见菌落后，计算每毫升中的微生物数量。
g. 记录结果。

5.10 身份识别

An **鉴别试验** 在附录-2中进行了控制库存的盘点，并进行了记录。
5.11 促进生长的培养
从深冻柜中取出冷冻管并做好记录，使用微量移液器将0.1毫升的悬浮液接种到每个2X10毫升的相关液体培养基中，然后丢弃冷冻小瓶。在适当的温度和时间下培养试管。
b. 对于 A.niger（一种微生物）：将 1 毫升菌液接种到含有 1 毫升无菌水的 10 厘米马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板中。将培养皿放入保温袋中，在 22.5 ± 2.5°C 的温度下培养 7 天。
5.12 在新鲜培养基中进行接种及斜面培养的制备：
再次使用微量移液器（0.1毫升）将菌种接种到2×10毫升的相关液体培养基中。在适当的温度下培养适当的时间，并记录相关数据。
b. 将每种培养物同时划线接种到相应的维持培养基上以进行保存，并做好记录。

5.13 接种液的制备

**用无菌生理盐水进行系列稀释，制备出浓度为10的悬浮液。**² cfu/ml.
5.13.1 关于 A.niger（具体含义需结合上下文确定，可能是指某种微生物、化学物质或药品成分）
在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的菌落生长情况。从0.1毫升的悬浮液中取10毫升（该悬浮液含有0.9% NaCl和0.05%聚山梨酯80），将其稀释至20毫升的0.9% NaCl和0.05%聚山梨酯80溶液中，然后再进一步稀释，最终得到10毫升的培养液用于接种。² cfu/ml（菌落形成单位/毫升）以及相关记录。
5.13.2 使用浓度为10-100 cfu/ml的接种物进行培养基的生长促进测试。
5.14 接种物的保存
1. 将接种物保持在2-8℃的温度范围内。 °C 保存温度为十五天。在丢弃之前，再次检查活菌计数。
2. 每十五天从保存的冷冻小瓶中重新制备新鲜的接种物。
3. 每次使用接种物时，需在同一天对该微生物进行活菌计数并记录结果。
5.15 注意事项
从深冻柜中取出培养物时，必须佩戴乳胶手套。
2. 收获完成后，必须更换工作服。
3. 所有被微生物污染的玻璃器皿和材料都会被送入高压灭菌器进行灭菌处理。
5.16 ATCC/MTCC/NCTC菌种的培养管理
1. 在从深冻柜中取出后的2小时内进行处理，并按照标准操作规程（S.O.P.）将使用过的冷冻管及其他受污染的材料放入121°C的灭菌循环中灭菌30分钟。灭菌完成后，立即处理这些材料并丢弃。
2. 所有的转移操作和促生长处理都必须在安全柜内进行。
3. 取出冷冻管后，立即锁好深冷冰箱。

6.0 缩写

6.1°C = 摄氏度
6.2 hrs. = 小时
6.3 NaCl = 氯化钠
6.4 cfu = 菌落形成单位
6.5 ml = 毫升