生物指示物检测的标准操作规程（SOP）

1.0 目的

制定用于灭菌验证的生物指示物检测程序。

2.0 范围

本标准操作规程（SOP）适用于生物指示物（BI）的检测工作，包括接收时的检测（孢子数量验证和微生物种类鉴定），以及经过灭菌验证处理的生物指示物的检测。

3.0 责任

受过培训的质量控制微生物学家负责按照标准操作规程（SOP）的要求进行检测工作。

4.0 责任制

部门主管

5.0 程序/步骤

5.1 通用说明

5.1.1 所有操作必须在生物安全柜或层流空气中进行。
5.1.2 处理生物指示物 请小心处理。
5.1.3 在丢弃之前，必须对所有使用过的玻璃器皿、溶液以及孢子悬浮液进行彻底的消毒处理。

5.2 在收到时对生物指示物进行检测

5.2.1 收到后 生物指标 验证并确保收到的批次中孢子数量至少为1×10^6个/克。⁶ 孢子/载体（条带或安瓿）以及 D-值 不少于1.5分钟。
5.2.2 记录上述信息，同时记录微生物的名称、制造商的名称以及产品的生产日期和有效期。

5.2.3 生物指示剂纸载体的样品制备

5.2.3.1 从待检测的批次中随机选取三个生物指标进行检测。
5.2.3.2 使用无菌镊子将生物指示剂载体（纸条或独立容器）从容器中取出，然后将其转移到装有30毫升冷却后的无菌纯化水（水中含有玻璃珠）的试管中。如有需要，可将纸条剪成小块。
5.2.3.3 将试管剧烈振荡约10分钟，直到试纸条被充分浸湿并变成细小的糊状物。
5.2.3.4 取10毫升样品，按照5.2.5的要求进行热休克处理和计数操作。

5.2.4 玻璃安瓿中生物指示物的样品制备 不锈钢 光盘；磁盘

5.2.5.1 从待检测的批次中随机选取三个生物指标样本，将其放入一个无菌的100毫升螺旋盖瓶中。
5.2.5.2 使用无菌棒或镊子将安瓿压碎成碎片。
5.2.5.3 用...冲洗粉碎设备。 无菌纯化水 当液体被加入瓶中后，需要将总体积调整至100毫升。例如，如果每个生物指示剂的液体体积为0.3毫升，则需要加入99.1毫升的无菌纯化水，以使总体积达到100毫升。
5.2.5.4 对于SS盘（无菌过滤盘），只需加入100毫升无菌纯化水即可。
5.2.5.5 将瓶子剧烈摇晃（涡旋）至少1分钟，以确保混合物均匀混合。
5.2.5.6 在进行超声处理之前，让瓶子静置至少5分钟，不要移动，以便气泡能够消散。
5.2.5.7 将样品在45–60 kHz的频率下进行超声处理3至5分钟。
5.2.5.8 在超声处理后，再次将样品剧烈涡旋至少1分钟，然后取10毫升样品，按照5.2.5.的步骤进行热休克处理和计数。

5.2.5 孢子数量计数

5.2.5.1 将试管置于水浴中，在95°C至100°C的温度下加热15分钟（对于Geobacillus stearothermophilus而言，从温度达到95°C时开始计时）；或者在80°C至85°C的温度下加热15分钟（对于Bacillus atrophaeus/subtilis而言，从温度达到80°C时开始计时）。
5.2.5.2 将试管从水浴中取出，迅速放入0°C至4°C的冰水浴中冷却。
5.2.5.3 将试管剧烈振荡（涡旋），然后取2毫升样品转移到两个装有9毫升无菌纯化水的试管中。
5.2.5.4 从每个试管中制备十倍系列稀释液，直至获得可计数的菌落。例如，如果标记的孢子数量为…… 10⁶ 然后制备相应的稀释液。 10⁶在继续进行后续稀释操作之前，请将试管剧烈涡旋至少10秒钟。
5.2.5.5 从每组至少最后3个稀释液中各吸取1毫升，分别加入预先标记好的无菌90毫米培养皿中，每个稀释液重复操作两次。吸取前请先涡旋混匀样品。
5.2.5.6 在每个培养皿中倒入约20毫升冷却至45至50°C的无菌大豆酪蛋白消化琼脂。
5.2.5.7 旋转培养皿以确保充分混合，并让琼脂凝固。
5.2.5.8 将培养皿倒置后，在55°C至60°C的温度下培养Geobacillus stearothermophilus，在30°C至35°C的温度下培养Bacillus atrophaeus或Bacillus subtilis。
5.2.5.9 在24小时和48小时后观察培养皿，并记录每个培养皿中的菌落数量。选择在48小时后菌落数量在30到300之间的稀释度来计算最终结果。
5.2.5.10 根据分析结果，使用适当的稀释因子和检测单位，计算每个样本中的平均孢子数量。

5.2.6 微生物的鉴定与特性分析

5.2.6.1 从最初制备的三个稀释液中的一个中取出一环稀释液，然后将其涂布在两个大豆酪蛋白消化琼脂平板上。
5.2.6.2 将一个平板在30–35°C下培养24小时，另一个平板在55–60°C下培养24小时。
5.2.6.3 在培养完成后，观察是否有微生物生长，并进行革兰氏染色。

5.2.7 接受标准

5.2.7.1 如果在48小时时，每个载体上的孢子数量的对数值等于或大于24小时后的孢子数量的对数值，则孢子计数结果是有效的。
5.2.7.2 如果每个载体上的活孢子平均数对数的值不低于标示的孢子计数对数的0.3倍，且不超过标示孢子计数对数的0.48倍（回收率为50%至300%），同时孢子总数达到最低要求，则认为孢子计数试验的要求得到了满足。 1x10⁶ 每个载体上的孢子数量。
5.2.7.3 对于嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），该菌应在55–60°C的温度下生长，而在30–35°C的温度下不应生长。经过染色处理后，该菌应表现出特定的染色特征。 革兰氏阳性 具有椭圆形内孢子的杆状细菌，这些内孢子位于细胞末端略微膨胀的部分。
5.2.7.4 对于枯草芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）/枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌应在30–35°C的温度下生长，在55–60°C的温度下不应生长。经染色后，该菌应呈现革兰氏阳性杆菌状，其内孢子呈椭圆形且位于细胞中央，同时细胞不会发生膨胀。

5.3 生物指示物的检测在灭菌验证中的应用

5.3.1 对所使用的生物指标的检测 灭菌验证 应在卸货后四小时内进行培养。
5.3.2 生物指示条的检测
5.3.2.1 将同一批次的生物指示物以及一个未暴露的指示物（阳性对照）转移到微生物检测实验室。
5.3.2.2 使用永久性记号笔在装有10毫升无菌大豆酪蛋白消化培养基的试管上标注验证识别编号、条码编号以及测试（接种）日期。将其中一个试管标记为阳性对照管，另一个标记为阴性对照管。
5.3.2.3 拆开单个试纸条的包装容器，使用无菌镊子取出试纸条，并将其转移到标记正确的试管中。确保试纸条完全浸入培养基中。
5.3.2.4 在将所有试纸条转移完毕后，将阳性对照试纸条转移到标有“阳性对照”的试管中。
5.3.2.5 将所有试管在55°C至60°C的温度下培养Geobacillus stearothermophilus，在30°C至35°C的温度下培养Bacillus atrophaeus/枯草芽孢杆菌，培养时间为7天。
5.3.2.6 每天观察试管，并在7天培养期后记录结果。阳性对照通常在24至48小时内出现生长现象。一旦在阳性对照中观察到生长，应立即记录下来，然后对其进行消毒处理并丢弃。

5.3.3 自含生物指示物的检测 / 生物指示剂安瓿的检验

5.3.3.1 按压自含生物指示剂的容器，使装有培养基的玻璃安瓿/试管释放到容器内部，确保生物指示剂条/盘与培养基充分接触。同样地，按压一个未暴露的生物指示剂单元（阳性对照）。保留一个未破坏培养基容器的生物指示剂单元（阴性对照）。
5.3.3.2 对于含有生物污染的安瓿以及暴露于灭菌过程中的安瓿，应使用一个阴性对照安瓿（由制造商提供，未添加任何孢子）和一个未暴露于灭菌过程的安瓿（阳性对照）来自同一批次。
5.3.3.3 将所有样品在55°C至60°C的温度下培养Geobacillus stearothermophilus，在30°C至35°C的温度下培养Bacillus atrophaeus/枯草芽孢杆菌，培养时间为48小时。
5.3.3.4 每天观察培养结果并记录下来。阳性对照通常在24到48小时内会出现生长现象；一旦在阳性对照中观察到生长，应立即记录下来，然后对其进行消毒处理并丢弃。
如果多个灭菌批次的生物指示物（BI）在同一天接种并培养，可以使用一个阳性对照和一个阴性对照。

5.3.4 接受标准

5.3.5.1 如果阳性对照中观察到生长现象，而阴性对照中未观察到生长现象，则该测试结果有效。
5.3.5.2 如果在所有生物指示物中均未观察到生长现象，则所测试的灭菌周期/模式被视为验证通过。
相关： 新型基因工程生物指示剂

6.0 缩写词

6.1 标准操作规程（Standard Operating Procedure）
6.2% - 百分之六点二
6.3 °C - 摄氏度
6.4 毫升
6.5 CFU - 菌落形成单位
6.6 BI - 生物指示剂
6.7 LAF - 层流空气
6.8 BSC - 生物安全柜