标准微生物菌种的采购、保存及传代培养操作规程

微生物名称及菌株编号：

收到日期：

使用前：

微生物学家的签名：

5.4 培养物的复苏

5.4.1 应将冻干安瓿/培养斜面/培养条从冰箱中取出，并让其适应室温。
5.4.2 在涉及母培养物的情况下 冻干安瓿安瓿瓶的表面应... 使用70%异丙醇（IPA）进行消毒。 并在层流空气（LAF）条件下使其干燥。
5.4.3 用无菌安瓿切割器在安瓿的中间位置做标记。
5.4.4 用厚实的无菌棉布包裹住安瓿瓶，然后在标记的位置小心地将其折断。
5.4.5 轻轻去除安瓿瓶的尖端。如果强行打开瓶口，棉塞会被拉到一端；而如果操作过于匆忙，干燥的微生物颗粒可能会释放到实验室的空气中。
5.4.6 小心地取出棉塞，然后用无菌移液管加入约0.3至0.4毫升的指定液体培养基。操作过程中要避免产生泡沫或气溶胶。
5.4.7 将混合物充分混合后，接种到100毫升的灭菌液体培养基中，置于试管中。
5.4.8 如果使用斜面培养的母培养物，应使用接种环从培养物上取样，并将其接种到100毫升的灭菌液体培养基中，置于试管中。
5.4.9 如果使用的是培养棒进行接种，应先取出培养棒，然后将其浸入100毫升的培养基中再进行接种操作。 灭菌液体培养基 在试管中，需要手动将试纸条在培养基中旋转。
5.4.10 使用的冻干安瓿/培养斜面/培养棒应浸入10%的Virosil Pharma（过氧化氢溶液）中。
5.4.11 经过消毒的冻干安瓿/培养斜面/培养棒必须在……中进行去污处理。 在121-124°C的温度下进行高压灭菌处理。 持续30分钟。
5.4.12 将含有培养物的接种液体培养基放入试管中，按照表I中描述的条件进行培养。
5.4.13 在培养期间，应每隔24小时检查一次富集管中的细菌和酵母培养物的浑浊度，以及真菌培养物的菌丝生长情况。
5.4.14 在对富集管进行每24小时一次的观察期间，如果发现有生长现象，应将这些培养物转入下一阶段的纯度检测和转移操作。
5.4.15 如果在表I中规定的时间内未观察到生长现象，则应对下一组培养物执行4.1至4.8条款中的操作。

5.5 纯度检测

5.5.1 在富集培养基中观察到生长后，应对所有培养物进行纯度检测，并按照表-II中的描述同时将其划线接种到维持培养基中。对于Clostridium sporogenes ATCC-11437的培养，应在Cooked Meat Medium/Thio Glycollate Agar (TGA)培养基中进行穿刺接种。
5.5.2 对所有培养物，应按照以下列出的参数进行纯度检测。
5.5.3 革兰氏染色 用于细菌培养的反应；用于酵母培养的简单染色方法；以及用于真菌鉴定的乳酚棉蓝染色法。
5.5.4 在选择性培养基中的生长情况与菌落形态。
应对这些微生物进行5.5.5革兰氏染色反应/简单染色/乳酚棉蓝染色，并做好相关记录。
5.5.6 应按照表-III中规定的纯度检测参数来进行培养物的检测。
5.5.7 需要观察并记录在选择性培养基中的生长情况、菌落形态以及革兰氏染色结果。
5.5.8 根据革兰氏染色反应、简单染色或乳酚棉蓝染色结果、在选择性培养基上的生长情况以及菌落形态，应按照表III中的描述确认该培养物的纯度。
5.5.9 如果纯度检测中培养物不合格，应通知供应商，并要求提供新的培养物。随后需重新执行4.0和5.0节中提到的各项步骤，以确认培养物的纯度。
5.5.10 在培养斜面上观察到生长后，富集培养基中的母培养物应被丢弃。
5.5.11 主斜面/底部仅在12个月期限结束后才应丢弃。
5.5.12 在十二个月期限届满后，应从供应商处重新采购新鲜的冻干安瓿/斜面培养管，并重新执行复苏及培养转移的程序。
5.5.13 如果在2-8°C的温度下保存，斜面培养基中接收到的母培养物可以在收到后的12个月内使用。超过保质期后，这些培养物应在12个月后丢弃。
5.5.14 在12个月期限结束时，应按照第2.1条的规定采购新的冻干安瓿/斜面培养管，并重新执行相关程序以恢复培养物并转移培养物。

5.6 格兰氏染色技术

5.6.1 将待检测的培养物制备成薄涂片，涂在干净且干燥的玻璃片上，然后通过轻轻在火焰上加热来进行固定。待玻片冷却后使用。
5.6.2 在涂片上加入3-4滴主要染色剂（即革兰氏结晶紫溶液），静置一分钟。
5.6.3 用流动的自来水冲洗结晶紫溶液，然后晾干。
5.6.4 加入3-4滴格拉姆碘溶液，静置1-2分钟。
5.6.5 用流动的自来水冲洗 Gram 碘溶液，然后让其自然风干。
5.6.6 在被污染的载玻片上加入3-4滴Grams脱色剂，静置30-60秒。
5.6.7 用流动的自来水冲洗 Grams 脱色剂，然后晾干。
5.6.8 在载玻片上加入3-4滴复染剂（例如2.5%（w/v）的藏红花素溶液），静置一分钟。
5.6.9 用流动的自来水冲洗番红花素溶液，然后晾干。
5.6.10 用10倍和40倍的物镜在显微镜下观察载玻片，并使用油浸物镜进行观察；将观察结果记录下来。
5.6.11 观察另外两个试管中微生物的生长情况，并检查培养物的纯度（应仅存在一种类型的菌落）。

5.7 培养物转移（频率：每月一次）

5.7.1 主培养基（SCDA/SDA）斜面、TGA培养基或煮熟的肉培养基中的菌株应被视为第一代/批次。
5.7.2 从主斜面/菌种管中，将菌种划线/接种到维持培养基的斜面/菌种管上，并按照表II中规定的条件进行培养。
5.7.3 定期按照培养物转移的时间表进行操作。
5.7.4 在检查了原始菌种的纯度后，应准备每种微生物的3个传代培养物。
5.7.5 应将一个培养管标记为“储备培养物（SC1）”，另外两个标记为“传代培养物（A1）”和“传代培养物（B1）”。其中，（A1）仅用于传代培养，（B1）用于日常使用。
5.7.6 一个月后，应从传代培养物（A1）中制备两个新的传代培养物。其中一个标记为传代培养物（A2），另一个标记为传代培养物（B2）。
5.7.7 亚培养物（A2）仅用于亚培养目的，而（B2）则用于常规使用。
5.7.8 该程序需重复进行4个月，最终获得稳定的传代培养物（A4）和（B4）。
5.7.9 四个月后，从储备培养物（SC1）中制备3份子代培养物。
5.7.10 将一个培养管标记为“储备培养物（SC2）”，另外两个标记为“传代培养物（A1）”和“传代培养物（B1）”。
5.7.11 重复第7.3至7.6节中的步骤，进行进一步的传代培养，直至达到（SC3）要求。
5.7.12 记录所有传代培养的详细信息。
5.7.13 根据培养物的有效期要求，将其丢弃。
5.7.14 在下表II中规定的培养基上，按照相应的培养时间和温度条件培养以下微生物：
5.7.15 在培养物生长旺盛后，按照以下方式标记子培养物：

微生物名称及菌株编号：

传代培养编号：

转接培养日期：

传代培养截止日期：

微生物学家的签名：

5.8 环境分离株的转移

5.8.1 环境分离株应接种在琼脂斜面上进行培养。
5.8.2 细菌分离株应接种在豆酪消化琼脂斜面上培养，真菌则应接种在沙氏葡萄糖琼脂斜面上培养。
5.8.3 在对 SCDA 斜面进行传代培养后，应在 30-35°C 下培养 24-48 小时；对于 SDA 斜面，则应在 20-25°C 下培养 3-5 天。
5.8.4 孵育完成后，应检查斜面培养基上的生长情况。在斜面上发育良好的菌落应按照第8.6条的要求进行标记，并记录相关细节。
5.8.5 应对培养过程中保存的环境分离株每三个月进行一次传代培养。
5.8.6 环境分离株的标签

环境分离株编号：

转接培养日期：

传代培养截止日期：

微生物学家的签名：

5.9 培养物的储存

5.9.1 主斜面/平板、工作斜面/平板必须贴上标签，试管和平板中的棉塞需用聚膜密封，并存放在2-8°C的冰箱中。
5.9.2 使用后，应将培养物重新置于2-8°C的冰箱中保存。

5.10 培养物的处置

5.10.1 使用后需要丢弃的培养物应装入容器中，然后在121-124°C的温度下进行30分钟的高压灭菌处理。
5.10.2 在去污工作完成后，相关介质必须进行焚烧处理。

6.0 缩写词

6.1 标准操作规程（Standard Operating Procedure）
6.2 LAF - 层流空气
6.3% - 百分之六点三
6.4 °C - 摄氏度
6.5 克
6.6 ml - 毫升
6.7 CFU - 菌落形成单位