细菌内毒素检测（BET或LAL检测）方法验证

1.0 引言

革兰氏阴性细菌产生的内毒素是导致药品受到热原污染后引发毒性反应的最常见原因；其致热活性远高于大多数其他热原物质。这些细菌内毒素属于脂多糖类。尽管存在少数结构不同的热原，但通常可以认为：如果能够排除非内毒素类热原物质的存在，那么产品中不含细菌内毒素就意味着产品中也不含任何热原成分。

产品中存在的内毒素可能会被某些因素所掩盖，这些因素干扰了细菌内毒素与变形虫细胞裂解液之间的反应。因此，希望替换现有检测方法的分析师需要…… 兔热原试验药典专论中要求对细菌内毒素进行检测，目的是证明能够对该产品实施有效的检测方法；这可能包括一种去除干扰因素的程序。

2.0 目标

本方案的目的是建立书面证据，证明按照标准操作规程执行葡萄糖注射液（5% w/v）的凝胶凝块法（BET测试）时，该工艺能够始终产生预期的结果。

3.0 范围

本方案适用于5%（重量/体积）葡萄糖注射液（Dextrose Injection IP），该产品需要进行细菌内毒素检测。

4.0 职责

S. No.	职责；任务；责任	部门名称
1	验证方案的制定	质量控制（Quality Control）
2	执行本方案	质量控制（Quality Control）
3	方案及最终报告的批准	质量保证（Quality Assurance）
4	系统可接受性的最终确定	AGM Works
5	数据的审查与整理，形成最终报告。	质量控制（Quality Control）

5.0 先决条件

为了高效地使用凝胶凝块法（Gel Clot method）对葡萄糖注射液（5% w/v）中的细菌内毒素含量进行验证，必须确保满足以下要求：
具备适当的 BET（比表面积）测试设施。
2. 所有用于方法验证的仪器均已通过确认（qualification），并且相应的标准操作规程（SOP）已经制定并得到严格执行。
3. 玻璃器皿应当清洗干净，微量移液器必须精确无误，稀释管也必须经过适当的去热原处理。
4. 经过培训的人员负责进行BET测试及其验证工作。

6.0 设备/系统描述

1. 地点：质量控制部门
2. 设备：包括 BET 加热块和热风烘箱。

7.0 材料与方法

去热原处理过的10x75毫米玻璃管
2. 去热原处理的硼硅酸盐玻璃管，规格为16x125毫米。
3. 加热块在孵育前被设定并维持在37ºC ± 1ºC的温度。
4. 旋涡混合器。
5. 计时器。
6. 无菌且去热原处理的新鲜一次性移液器吸头。
7. 校准过的移液器。
8. 试管架。
9. LAL试剂（溶菌液）。
10. 控制标准内毒素（Control Standard Endotoxin, CSE）。
11. LAL试剂用水。
12. 5%葡萄糖注射液（注射用）

8.0 制剂详细信息

所有瓶子在...之后都被抽取样本用于BET验证研究。终端灭菌详细信息如下。

S. No.	产品名称	批号	批量大小	取样日期	抽取了样品的瓶子。	由...取样	签名；署名
1.
2.
3.

9.0 验证测试

通过凝胶凝块法进行细菌内毒素检测的验证，需按照以下方法进行：
A. 标记的LAL试剂灵敏度确认测试
B. 干扰因素检测

A. 用于确认标签上标注的LAL试剂灵敏度的测试

程序；步骤；操作规程

1. 按照制造商的说明，使用稀释液（LRW）重新配制标准内毒素（CSE）。这种重新配制后的CSE将作为库存使用。将小瓶中的内容物剧烈涡旋15分钟。
2. 将标准内毒素储备液用蒸馏水（LRW）进一步稀释，制备一系列标准溶液，浓度至少包括2λ、λ、0.5λ和0.25λ。
3. 按照制造商的说明重新配制LAL试剂。
4. 分别用移液器吸取100毫升稀释后的CSE溶液，稀释至2λ、λ、0.5λ和0.25λ的浓度。 **去热原的** 硼硅酸盐试管（尺寸：10毫米 x 75毫米），并相应地进行标记。空白试管需单独使用100毫升的蒸馏水（LRW），测试需重复进行四次（四重复）。
5. 向每个试管中加入100毫升复溶后的裂解物，然后轻轻混合。
6. 将所有试管放入块式加热器中，在37 ± 1ºC的温度下孵育60 ± 2分钟。立即开始计时。
7. 在培养60分钟后，通过轻轻将试管倒置180度（动作要平稳流畅），观察是否形成凝胶。
8. 如果在倒置后形成了并且保持原位的凝胶，记录该结果为“阳性”。如果没有形成完整的凝胶，则结果为“阴性”。
9. “终点”是指在内毒素浓度逐渐降低的过程中出现的最后一个阳性结果。计算这些终点浓度的对数值的平均值，然后使用以下公式计算该平均值的反对数。
几何平均终点浓度 = antilog Se/f
Se = 所用稀释系列对数终点浓度的总和
f = 重复实验的次数。

验收标准

除非标准溶液的最低浓度在所有重复试验中均显示阴性结果，否则该测试无效。
2. 几何平均终点浓度是指测量得到的数值。裂解产物的敏感性溶液浓度（单位：EU/ml 或 IU/ml）。如果该浓度不低于 0.5λ 且不高于 2λ，则确认标签上标注的灵敏度是准确的。

B. 检测干扰因素

程序；步骤；操作规程

根据制造商的说明，使用稀释液（LRW）重新配制标准内毒素（CSE）。这种重新配制后的CSE将作为库存使用。剧烈涡旋瓶子15分钟。
2. 根据公式计算样品的 MVD（最小有效剂量）。

MVD = 细菌内毒素限度 × 制剂的效力
裂解物敏感性

MVD = 0.5 EU/ml × 1 ml/ml
0.03 EU/ml

MVD = 1:16
MVD/4 = 1:4

3. 将样品稀释至MVD/4浓度，即取300µl样品和900µl稀释液（LRW），然后在涡旋振荡器上振荡3分钟。
4. 准备溶液A（即阴性产品对照品，NPC），在10个70毫米的去热原处理试管中，每个试管分别加入50毫升产品样品（浓度为MVD/4）、50毫升稀释液（LRW）和100毫升裂解液（Lysate），重复四次实验。将这四个试管分别标记为A1、A2、A3和A4。
5. 准备溶液B（即阳性产品对照品，PPC），具体操作如下：向经过去热原处理的试管中分别加入50微升浓度为4λ、2λ、λ和0.5λ的内毒素标准品，这些试管分别标记为B2λ、Bλ、B0.5λ和B0.25λ，每组重复四次。随后，在标记为B2λ、Bλ、B0.5λ和B0.25λ的试管中，分别加入50微升已稀释至MVD/4浓度的产品样品。
6. 准备溶液C（即阳性水对照品，PWC），方法是将50毫升浓度分别为4λ、2λ、λ和0.5λ的内毒素标准品分别加入去热原处理的试管中，这些试管分别标记为C2λ、Cλ、C0.5λ和C0.25λ。随后向标记为C2λ、Cλ、C0.5λ和C0.25λ的试管中各加入50毫升稀释缓冲液（LRW）。
7. 准备溶液D（即阴性水对照品，NWC），方法是在10个70毫米的去热原处理试管中，每个试管分别加入100毫升蒸馏水（LRW）和100毫升裂解液（Lysate），重复四次实验。将这些试管分别标记为D1、D2、D3和D4。
8. 最后，在每个试管中分别加入100毫升裂解液：从阴性对照开始，依次加入溶液A、溶液B和溶液C中内毒素浓度最高的样品。

表 - I

溶液；配方；解决办法	样品管名称	LRW	产品MVD/4	CSE	LAL	重复次数
A (NPC)	-	50毫升	50毫升	-	100微升	4
B （PPC）	2λ	-	50毫升	50微升的4λ	100微升	4
	λ	-	50毫升	50微升的2λ	100微升	4
	0.5λ	-	50毫升	50微升的 λ	100微升	4
	0.25λ	-	50毫升	50微升的0.5λ	100微升	4
C （PWC）	2λ	50毫升	-	50微升的4λ	100微升	4
	λ	50毫升	-	50微升的2λ	100微升	4
	0.5λ	50毫升	-	50微升的 λ	100微升	4
	0.25λ	50毫升	-	50微升的0.5λ	100微升	4
D (NWC)	-	100毫升	-	-	100微升	4

9. 根据表-I的要求，为所有三个批次准备相同的样品溶液。
10. 将所有试管放入块式加热器中，在37 ± 1ºC的温度下孵育60 ± 2分钟。立即开始计时。
11. 在培养60分钟后，通过轻轻将试管倒置180º并完成一次平稳的动作来观察凝胶是否形成。
12. 如果在倒置后形成了并且固定不动的凝胶，记录该结果为“阳性”。如果未形成完整的凝胶，则结果为“阴性”。
13. 计算溶液B和溶液C的终点浓度对数值的平均值，然后使用以下公式计算这两个溶液平均值的反对数：
几何平均终点浓度 = antilog Se/f
Se = 所用稀释系列对数终点浓度的总和
f = 重复实验的次数。

验收标准

该测试无效，除非溶液A和D的所有重复实验均无反应，并且溶液C的结果能够证实标签上标注的裂解物（Lysate）的敏感性。
2. 使用溶液B测定的裂解物（lysate）的灵敏度不低于0.5λ且不高于2λ，在所使用的实验条件下，测试溶液中不含有任何干扰因素。

注意事项

必须保持严格的无菌条件，以避免微生物污染。污染；杂质.
2. 所有容器和设备必须通过在干热灭菌器中以250ºC的温度进行60分钟的去热原处理来确保无细菌内毒素。
3. 必须准确控制培养过程中的时间和温度。
4. 在孵育过程中不应有任何干扰。
另请参阅：
细菌内毒素检测方法
**凝胶凝集法检测内毒素**
**定量方法检测细菌内毒素**
通过凝胶凝集限度试验方法检测细菌内毒素
半定量凝胶凝集法检测细菌内毒素
通过动态浊度法和动态显色法检测细菌内毒素
**终点显色法检测内毒素**