纯培养物的分离与保存技术
- 在自然界中，很难找到纯种的微生物培养物，因为它们总是处于混合状态。
- 由于这些培养物是在实验室中纯化的，并在那里保存了较长时间，因此它们是从不同的来源获取的，用于研究目的。
- 有一些著名的实验室，例如印度国家化学实验室（National Chemical Laboratory, India Limited）、英国的国家典型培养物收藏中心（National Collection of Type Cultures, NCTC）以及美国典型培养物收藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。
纯培养技术
纯培养中的微生物是指属于单一物种的微生物。使用纯培养技术从混合物中分离出这些微生物的过程被称为纯化。有许多重要的纯培养技术，其中包括……- 划线平板法
- 微操纵器方法
- 平板计数法
- 倾注平板法
- 循环稀释技术
- 系列稀释技术
- 滚管法
划线平板法
- 最常见的方法是分离纯化的细菌。
- 使用接种环或针尖将混合培养物涂布在琼脂培养基上。
- 涂上一层薄薄的接种物，然后通过划线的方式将微生物分开。
- 允许这些培养基平板上生长菌落。
- 当细菌被接种到琼脂表面时，"Striking" 方法会在培养皿的整个表面上建立一个稀释梯度。
- 由于这种稀释梯度的作用，细菌在含有最少细菌细胞的培养基部分会呈现“汇流生长”（confluent growth）现象。
- 当每个菌落都是纯培养物的克隆时，构成该菌落的微生物细胞就是该菌落的来源。
- 为了确保纯度，需要使用无菌接种环/针头将分离出的菌落挑取出来，然后将其接种到新鲜的培养基上。
微操纵器方法
- 使用这种技术可以分离出单个细胞。
- 有一些微型操作装置可以用来从细胞混合物中单独提取出一个细胞。
- 借助该仪器，可以从液体中提取出一个单独的细菌细胞（通常来自悬滴制备）。
- 微米级的调节使得微操纵器的微吸管能够精确地移动到右侧、左侧、前方和后方。
- 为了将稀释后的培养液滴在无菌盖玻片上，使用微量移液器制造出一系列悬挂的液滴。
- 目前正在进行一项针对仅含有一个微生物细胞的悬滴的调查。
- 使用 gentle suction to draw the cells into the micropipette, and then place a drop of sterile medium on a sterile coverslip.
- 随着细胞通过分裂增殖，液滴中的细胞数量增加，随后这些细胞会被转移到含有适宜培养基的培养管中。
- 所获得的纯培养物中包含目标病原体。
- 这种方法的一个优点是能够确保所获得的培养物确实来源于单个细胞，并且有可能从单一物种的生物体中分离出相应的菌株。
- 这台设备价格昂贵，需要大量的人工操作，而且没有熟练的操作员的话很难使用。
- 这种技术仅用于高度专业化的研究，原因就在于此。
平板计数法
- 该方法使用的培养基是无菌的，通常是水或生理盐水，而不是融化的琼脂。与倾注平板法不同，这种方法不需要在融化的琼脂中进行稀释。
- 使用一根经过灭菌处理的弯玻璃棒，从每个试管中取出一滴稀释后的液体，将其与另一根灭菌处理的弯玻璃棒混合，然后均匀地涂布在琼脂平板上。
- 在琼脂培养基平板上，有些平板上的菌落生长得非常分离、清晰；而另一些平板上的菌落则生长得不够分离、不够清晰。
- 将一滴稀释后的液体涂抹在培养基上，以分离出单个微生物。
- 然后，将每个菌落从培养板上移除并转移到新的培养基中，以确保其纯度。
倾注平板法
- 琼脂培养基被熔化后，与稀释好的样品混合，然后进行接种培养。
- 在琼脂平板中，主要目的是通过将接种物逐次稀释到不同试管中的液化琼脂中，来实现细菌在整个培养基中的均匀分布。
- 将混合的细菌菌株直接在42-45°C的温度下，加入到已经融化的琼脂培养基中，并进行稀释处理，随后将这些稀释后的菌液加入到液体琼脂试管中。
- 熔化的培养基与细菌充分混合。
- 在培养物凝固后，将试管内的内容物分别接种到不同的培养皿中。
- 细菌菌落的生长特征是在琼脂培养基中同时形成深层菌落和表层菌落。
- 然后使用环状工具将分离出的菌落转移到另一个培养皿上，以确保它们的纯度得以保持。
系列稀释技术
- 使用无菌水或生理盐水来稀释原始接种物。
- 将稀释液置于无菌培养皿中，在45°C下与液体营养琼脂混合，然后倒入培养皿中，待其固化后再次进行培养。
- 使用这种方法，可以分离出专性厌氧菌。
- 惰性气体或二氧化碳被泵入试管中以去除氧气。
- 使用营养琼脂，在50°C下融化2毫升，然后将其1毫升加入试管中并搅拌均匀。
- 为了将琼脂薄膜固定在试管的侧面，需要加入接种物，然后将试管在流动的水下滚动。
- 培养后，会形成菌落。
倾注平板法的缺点
很难分离并计数那些在地面下形成的菌落。
使用热能。
不适合用于分离嗜冷菌。
需要专业知识，并且需要花费时间。