检测工作应尽快完成，并在整个过程中注意尽量减少样品与空气及光线的接触，可通过使用惰性气体和低辐射玻璃器皿来实现。所有操作都应在光线较暗的环境中进行。
**注意：** 如有必要，可通过在室温下的真空烘箱中干燥来调整水分含量，补充所需的水分，并通过摇晃2小时使其达到平衡状态。
第2列：一根色谱管（长度20厘米，内径5毫米），管子下端装有烧结玻璃圆盘和一个小阀门。
将2毫升浓度为0.03%（w/v）的麦角钙化醇溶液转移至色谱柱的顶端，然后用不超过5毫升的2,2,4-三甲基戊烷冲洗色谱柱。接着用2,2,4-三甲基戊烷进行洗脱，调整洗脱流速，使其从色谱柱底部流出时的速度为每分钟2至3毫升，并收集连续5毫升的洗脱液。
测量每个组分在约263纳米处的最大吸光度，从而确定相对于洗脱液体积而言，麦角钙化醇的洗脱开始和结束的位置。
第2列：将5克吸附剂与适量的2,2,4-三甲基戊烷混合，制成浆液，然后将该浆液转移到色谱管中。使用玻璃活塞小心地密封色谱管，并丢弃洗脱液。
允许分离出水层，将水层转移到第二个分离器中，然后用三份体积各为30毫升的醚进行萃取。将每次萃取得到的醚层加入到第一个分离器中的液体中，最后丢弃水层。接着，向醚层中分别加入两份体积各为100毫升的水（过程中不要摇晃），并丢弃每次得到的水层。再向醚层中分别加入三份体积各为10毫升的水，每次加入后轻轻搅拌，然后丢弃水层。重复此过程，直到得到的水层呈中性为止。 酚酞溶液.
用无水硫酸钠进行干燥处理，以去除溶剂中的水分；然后倾析出溶剂部分，用少量乙醚依次洗涤残留物。将洗涤液和残留物合并后，在水浴中蒸发至体积约为5毫升。冷却后，在氮气保护下继续蒸发至完全干燥。将干燥后的残留物溶解在5.0毫升的三甲基戊烷中，即得到样品制备液。
使用5毫升的2,2,4-三甲基戊烷将样品转移至色谱柱1的顶部，然后用2,2,4-三甲基戊烷对色谱柱进行洗脱。调整洗脱液的流速，使其从柱底流出时的速度为每分钟2至3毫升，并收集据色谱柱标准化结果判断含有钙化醇的洗脱部分。
将从色谱柱1收集的洗脱液转移到色谱柱2的顶部，让液体流动；向色谱柱2的顶部加入10毫升三甲戊烷，然后丢弃洗脱液。接着用50毫升苯对色谱柱进行洗脱，将洗脱液在蒸发器上蒸发。 水浴 将液体体积调整至约5毫升，冷却后，在氮气流中蒸发至干涸，然后将残留物溶解在4.0毫升纯化的1,2-二氯乙烷中，得到样品溶液（溶液A）。
向三个试管中各加入1.0毫升溶液A。在第一个试管中，再加入1.0毫升由等体积的纯化1,2-二氯乙烷和乙酸酐混合而成的溶液，以及10.0毫升溶解在纯化1,2-二氯乙烷中的三氯化锑溶液。在第二个试管中，也加入1.0毫升纯化1,2-二氯乙烷和10.0毫升三氯化锑溶液。在第三个试管中，加入1.0毫升维生素D的标准溶液，以及10.0毫升溶解在纯化1,2-二氯乙烷中的三氯化锑溶液。
0.04(A1-A2)
(A3-A2)
“Where...”
A1 = 第一支试管中溶液的吸光度值；
A2 = 第二支试管中溶液的吸光度值；
A3 = 第三支试管中溶液的吸光度值。
1毫克的麦角钙化醇或胆钙化醇相当于40,000国际单位的维生素D。
特殊试剂
吸附剂：一种用于色谱分析的高纯度高岭土，例如 Florex XXS，或者是一种膨润土，其水分含量应不低于8.5%且不超过9.0%。 干燥失重 在105°C的温度下保持6小时。**注意：** 如有必要，可通过在室温下的真空烘箱中干燥来调整水分含量，补充所需的水分，并通过摇晃2小时使其达到平衡状态。
维生素D的标准制备方法
将0.01克麦角钙化醇RS或胆钙化醇RS（用于测定标示为含有麦角钙化醇或胆钙化醇的维生素D物质）溶解在足量的纯化1,2-二氯乙烷中，直至溶液浓度达到100.0 μmol/L。然后将10.0毫升该溶液用纯化1,2-二氯乙烷稀释至100.0毫升，得到每毫升含有1000国际单位（IU）维生素D的溶液。设备；仪器
色谱管
第1列：一根色谱管（长度25厘米，内径2.5毫米），其下端装有烧结玻璃圆盘或一小块玻璃棉塞，并配有一个阀门。第2列：一根色谱管（长度20厘米，内径5毫米），管子下端装有烧结玻璃圆盘和一个小阀门。
色谱柱
**第1列：** 将200毫升的2,2,4-三甲基戊烷与适量的聚乙二醇600混合并摇匀，直到形成两层。取上层100毫升，加入25克色谱用硅土，剧烈摇动使其形成稀浆状。然后分次加入10毫升聚乙二醇600，并持续搅拌2分钟，直至得到均匀的悬浮液。将此悬浮液分次转移到色谱管中，使用玻璃活塞轻轻吸出液体并小心填充每个色谱管。加入足够的悬浮液以形成所需长度的色谱柱，之后丢弃所有洗脱液。色谱柱的标准化
使用以下方法确定从色谱柱中回收的麦角钙化醇的体积。将2毫升浓度为0.03%（w/v）的麦角钙化醇溶液转移至色谱柱的顶端，然后用不超过5毫升的2,2,4-三甲基戊烷冲洗色谱柱。接着用2,2,4-三甲基戊烷进行洗脱，调整洗脱流速，使其从色谱柱底部流出时的速度为每分钟2至3毫升，并收集连续5毫升的洗脱液。
测量每个组分在约263纳米处的最大吸光度，从而确定相对于洗脱液体积而言，麦角钙化醇的洗脱开始和结束的位置。
第2列：将5克吸附剂与适量的2,2,4-三甲基戊烷混合，制成浆液，然后将该浆液转移到色谱管中。使用玻璃活塞小心地密封色谱管，并丢弃洗脱液。
程序；步骤；操作规程
准确称量约400单位维生素D的量。 胶囊可以将20粒胶囊的混合内容物用作样品。加入10毫升 freshly prepared的0.01%（重量/体积）丁基羟基甲苯乙醇溶液（95%乙醇），15毫升50%（重量/体积）氢氧化钾溶液以及5毫升乙醇（95%乙醇），然后在水浴中回流30分钟。冷却后，借助50毫升水将溶液转移到分离器中，再加入75毫升乙醚并剧烈摇晃。允许分离出水层，将水层转移到第二个分离器中，然后用三份体积各为30毫升的醚进行萃取。将每次萃取得到的醚层加入到第一个分离器中的液体中，最后丢弃水层。接着，向醚层中分别加入两份体积各为100毫升的水（过程中不要摇晃），并丢弃每次得到的水层。再向醚层中分别加入三份体积各为10毫升的水，每次加入后轻轻搅拌，然后丢弃水层。重复此过程，直到得到的水层呈中性为止。 酚酞溶液.
用无水硫酸钠进行干燥处理，以去除溶剂中的水分；然后倾析出溶剂部分，用少量乙醚依次洗涤残留物。将洗涤液和残留物合并后，在水浴中蒸发至体积约为5毫升。冷却后，在氮气保护下继续蒸发至完全干燥。将干燥后的残留物溶解在5.0毫升的三甲基戊烷中，即得到样品制备液。
使用5毫升的2,2,4-三甲基戊烷将样品转移至色谱柱1的顶部，然后用2,2,4-三甲基戊烷对色谱柱进行洗脱。调整洗脱液的流速，使其从柱底流出时的速度为每分钟2至3毫升，并收集据色谱柱标准化结果判断含有钙化醇的洗脱部分。
将从色谱柱1收集的洗脱液转移到色谱柱2的顶部，让液体流动；向色谱柱2的顶部加入10毫升三甲戊烷，然后丢弃洗脱液。接着用50毫升苯对色谱柱进行洗脱，将洗脱液在蒸发器上蒸发。 水浴 将液体体积调整至约5毫升，冷却后，在氮气流中蒸发至干涸，然后将残留物溶解在4.0毫升纯化的1,2-二氯乙烷中，得到样品溶液（溶液A）。
向三个试管中各加入1.0毫升溶液A。在第一个试管中，再加入1.0毫升由等体积的纯化1,2-二氯乙烷和乙酸酐混合而成的溶液，以及10.0毫升溶解在纯化1,2-二氯乙烷中的三氯化锑溶液。在第二个试管中，也加入1.0毫升纯化1,2-二氯乙烷和10.0毫升三氯化锑溶液。在第三个试管中，加入1.0毫升维生素D的标准溶液，以及10.0毫升溶解在纯化1,2-二氯乙烷中的三氯化锑溶液。
0.04(A1-A2)
(A3-A2)
“Where...”
A1 = 第一支试管中溶液的吸光度值；
A2 = 第二支试管中溶液的吸光度值；
A3 = 第三支试管中溶液的吸光度值。
1毫克的麦角钙化醇或胆钙化醇相当于40,000国际单位的维生素D。