标准储备溶液的制备
将25毫克的USP生物素RS溶解在500毫升容量瓶中的50%酒精中。用50%酒精将体积补足至500毫升并混合均匀。每毫升溶液中含有50毫克的USP生物素RS。将此溶液储存在冰箱中。
标准品制备
在检测当天制备标准溶液的稀释液。用足够的水稀释生物素的标准储备溶液，使其最终浓度为每毫升0.1纳克。
1毫升标准储备溶液---------500毫升（浓度为100 ng/ml）---溶液（a）
2. 1毫升溶液(a) ------------------------- 1000毫升溶液(b) （浓度为0.1纳克/毫升）
**样品制备**
在200毫升容量瓶中取相当于100毫克的样品。加入3毫升5%的酒精，摇匀后置于60-70°C的水浴中加热5分钟。进行超声处理5分钟，然后用5%的酒精稀释至刻度线。充分混合。
将样品稀释至含有100微克生物素的浓度——使用200毫升溶液（浓度为500纳克/毫升）。
2. 5.0毫升溶液（c）——→ 250毫升溶液（d）（浓度为10纳克/毫升）
3. 5.0毫升溶液（d）---------500毫升溶液（e）；浓度为0.1纳克/毫升（0.1 ng/ml）
酸水解酪蛋白溶液
将100克不含维生素的酪蛋白与500毫升6N盐酸混合，然后在减压条件下回流8至12小时。通过蒸馏去除混合物中的盐酸，直到只剩下浓稠的糊状物。将所得糊状物重新溶解在水中，用1N氢氧化钠调节溶液的pH值至3.5 ± 0.1，再加水至1000毫升。加入20克活性炭，搅拌1小时后过滤。重复此过程（即再次使用活性炭处理）。将处理后的溶液储存在含有甲苯的容器中，并置于温度不低于10°C的冰箱中。如果在储存过程中出现沉淀物，需再次过滤溶液。半胱氨酸-色氨酸溶液
将4克L-半胱氨酸悬浮在1.0克L-色氨酸（或2.0克D,L-色氨酸）中，加入700至800毫升水中，加热至70至80摄氏度，然后边搅拌边逐滴加入稀释的盐酸（浓度为1:2），直到固体完全溶解。冷却后，加水至1000毫升。将溶液储存在装有甲苯的容器中，并置于冰箱中，温度应不低于10摄氏度。腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液
将200毫克的硫酸腺嘌呤、200毫克的盐酸鸟嘌呤和200毫克的尿嘧啶分别加热溶解在10毫升4N盐酸中，冷却后加水至总体积为200毫升。将溶液储存在含有甲苯的容器中，并置于冰箱中保存。聚山梨酯-80溶液：
将25克聚山梨酯80溶解在酒精中，配制成250毫升的溶液。泛酸钙溶液
配制一种含有10微克/毫升钙泛酸酯的50%酒精溶液。将溶液储存在冰箱中。核黄素-硫胺素盐酸盐溶液：
配制一种含有核黄素和盐酸硫胺素的溶液：在0.02 N醋酸溶液中，每毫升含有20微克核黄素和10微克盐酸硫胺素。将此溶液储存在冰箱中，并用甲苯保护，避免光照。对氨基苯甲酸-烟酸-盐酸吡哆醇溶液
配制一种溶液，该溶液由水和中和后的酒精（比例为3:1）混合而成，每毫升溶液中含有10微克的对氨基苯甲酸、50微克的烟酸以及40微克的盐酸吡哆醇。将溶液储存在冰箱中。
盐溶液1： 将25克一碱式磷酸钾和25克二碱式磷酸钾溶解在水中，配制成500毫升溶液。加入5滴盐酸，然后混合均匀。将溶液储存在甲苯中。
盐溶液2： 将10克硫酸镁、0.5克氯化钠、0.5克硫酸亚铁和0.5克硫酸锰溶解在水中，配制成500毫升的溶液。加入5滴盐酸后搅拌均匀。将溶液储存在甲苯中。
基础培养基储备溶液
序号
|
溶液；配方；解决办法
|
数量；分量
|
1
|
酸水解酪蛋白溶液
|
25毫升
|
2
|
半胱氨酸-色氨酸溶液
|
25毫升
|
3
|
聚山梨酯80溶液
|
0.25 毫升
|
4
|
无水葡萄糖
|
10克
|
5
|
无水醋酸钠
|
5克
|
6
|
腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液
|
5毫升
|
7
|
泛酸钙溶液
|
5毫升
|
8
|
核黄素-硫胺素盐酸盐溶液
|
5毫升
|
9
|
对氨基苯甲酸-烟酸-盐酸吡哆醇溶液
|
5毫升
|
10
|
盐溶液1
|
5毫升
|
11
|
盐溶液2
|
5毫升
|
将无水葡萄糖和无水醋酸钠溶解在之前混合好的溶液中，然后用1 N氢氧化钠调节pH值至6.8。再用水稀释至250毫升，最后混合均匀。（Difco生物素测定培养基也可用作基础培养基，产品编号241910，包装规格为100克。）
植物乳杆菌（ATCC 8014）库存菌种的制备：
将2.0克酵母提取物溶解在100毫升水中，加入500毫克无水葡萄糖、500毫克无水醋酸钠和1.5克琼脂，然后在蒸汽浴中加热混合物，并不断搅拌，直到琼脂完全溶解。从热溶液中取10毫升倒入试管中，盖上试管盖子。 使用高压灭菌器进行灭菌处理。 在121°C的温度下进行灭菌处理，然后让试管保持直立状态冷却。使用纯化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，ATCC编号8014）在三个或更多的试管中制备接种培养物，将试管置于30°至37°C之间的温度下培养16至24小时，温度需控制在±0.5°C的范围内。培养完成后将试管存放在冰箱中。每周重新制备一次新鲜的储备培养物，且不得重复使用已培养过的培养物。 **接种物；菌种** 如果培养物已经超过1周的年龄（即培养时间超过1周）。
培养基的制备：
向每支装有5.0毫升基础培养基储备液的试管中加入5.0毫升含有0.5纳克生物素的水。用棉塞封住试管，然后在121°C的高压灭菌器中灭菌，之后冷却。
接种液的制备：
[注：如果冻存的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）悬浮液能够产生与新鲜培养物相当的接种量，那么就可以将其用作种子培养物。] 将植物乳杆菌种子培养物中的细胞转移到含有10毫升培养基的无菌试管中。在30°至37°的温度范围内（温度波动控制在±0.5°以内）进行16至24小时的培养。所得到的细胞悬浮液即为接种液。程序：
向大小相同的试管中分别加入1、2、3、4和5毫升的标准品溶液（各两份）。向每个试管以及另外4个不含标准品的试管中加入5.0毫升的基础培养基储备液，并加入足够的水使体积达到10毫升。向其他类似的试管中分别加入与标准品相同浓度的测定品溶液（各两份），浓度应至少为上述标准品浓度的3倍，包括2.0、3.0和4.0毫升这三个浓度。向每个试管中加入5.0毫升的基础培养基储备液，并加入足够的水使体积达到10毫升。然后盖上所有试管的盖子以防止污染。 污染；杂质 将以下英文内容翻译成简化的中文：
“将样品置于高压灭菌器中，在121°C下加热5分钟。高压灭菌后冷却试管。除了4个试管中的2个（作为未接种的空白对照管）外，向每个试管中加入一滴接种液并混合。将试管置于30°至37°C的温度下培养16至24小时，温度需保持恒定且偏差不超过±0.5°C。按照以下方法测定试管的透光度：混合每个试管的内容物，然后在540-660纳米波长范围内使用紫外分光光度计测量透光度。待达到稳定状态后读取数据。确保每个试管的测量时间间隔相同。以未接种空白对照管的透光度为1.00作为基准，读取其余各试管的透光度。如果发现样品受到外来微生物污染的迹象，则忽略该实验结果。”
计算：
准备一份标准文件。 浓度-反应关系 如下图所示的曲线：
对于每个标准水平，计算透射率重复值之和的差值，即 y = 2.00 - 透射率。将这个差值作为纵坐标，以每管标准品制备物的毫升数（ml）的对数作为横坐标，绘制在横截面纸上。可以选择算术刻度或对数刻度， whichever能更好地拟合一条直线。绘制一条最能拟合所绘点数的直线或平滑曲线。对于每个检测水平的样品制备物，通过将两个透射率值相加来计算响应值 y。从标准曲线上读取与这些 y 值对应的标准品制备物体积的对数，这些 y 值应在标准品所绘最低点和最高点范围内。从每个计算出的对数值中减去样品制备物体积的对数（单位：ml），以获得每个剂量水平的差值 x。对三个或更多剂量水平的 x 值进行平均，得到最终的 x 值。- =M，即测定样品制备物的对数相对效力。根据用于测定的样品中所含的生物素量，计算出相当于该生物素的 USP 生物素 RS 的质量（单位：mg），并以反対数形式表示：
M = antilog(M` + log R)
其中，R表示每毫克被用于检测的样品中假定所含的生物素（biotin）的毫克数。