叶酸或维生素B9的测定（微生物法）

测试菌株；试验用微生物

粪肠球菌（ATCC 8043）。

库存培养物

测试菌株的储备培养物是通过在叶酸培养基琼脂上划线接种来制备的。在35-37°C下培养20至24小时后，将试管放入冰箱中保存，并每天进行转接操作。

培养基

使用叶酸接种液培养基。将培养基用蒸馏水重新配制后，分装到10毫升的试管中，然后在121°C下进行15分钟的高压灭菌处理。

用于检测的接种物；用于分析的菌种/样本

此文件由……编制。 **子培养** 从菌种培养开始，最终得到10毫升的制剂（或成品）。 培养基将接种的培养物在37°C下孵育16-24小时。在无菌条件下，将培养物转移到离心管中，进行离心并弃去上清液。将细胞悬浮在5毫升的无菌生理盐水中，充分混合后再次离心并弃去上清液。重复此过程两次。最后，将细胞悬浮在5毫升的无菌生理盐水中并充分混合。然后向剩余的生理盐水中加入2-3滴该悬浮液，用这种悬浮液来接种检测管，每支检测管使用1滴接种物。 接种液悬浮液 这将取决于微生物学家需要验证的培养活性。

**测定培养基**

使用了叶酸测定培养基。该培养基用蒸馏水重新配制，并在水浴中加热以使其溶解。

标准制备；标准品制备

储备溶液

准确称量一定量的…… 工作标准；操作规范 相当于50毫克的叶酸活性，并将其转移到一个500毫升的容量瓶中。然后加入30毫升0.01M的NaOH溶液，使其溶解。用蒸馏水将体积补足至500毫升。1毫升的储备溶液含有100微克的叶酸。

工作标准溶液

每次检测前都要准备新鲜的样品。吸取5毫升储备溶液，用蒸馏水稀释至500毫升。再将其中2毫升溶液用蒸馏水进一步稀释至1000毫升。最终浓度为：1毫升该溶液含有2毫克的叶酸（Folic acid）。

样品制备：

准确称取约1毫克叶酸活性的片剂粉末，将其转移到1000毫升容量瓶中，并加入100毫升蒸馏水。然后加入30毫升0.01摩尔/升的氢氧化钠（NaOH）溶液。将混合物置于35°C至38°C的培养箱中孵育30分钟至1小时，并在此期间间歇性地摇晃样品溶液。孵育完成后冷却混合物并补足体积至1000毫升。让混合物静置沉淀，随后用蒸馏水稀释上清液，使其叶酸活性达到标准浓度（即2毫克/毫升）。

程序；步骤；操作规程

叶酸试管的制备： 为了制备18个150毫米的试管，分别向每个试管中加入0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0毫升的标准叶酸溶液（浓度为2 ng/ml）。然后向每个试管中加入蒸馏水，使体积达到5毫升。最后，向每个试管中加入5毫升的检测培养基。

样品管的准备：

为了复制这些试管中的样本，分别加入1.0毫升、2.0毫升、3.0毫升的样品溶液（稀释至接近标准溶液的浓度）。然后向每个试管中再分别加入……（后续操作内容未提供）。 蒸馏水 将体积调整至5毫升。最后向每个试管中加入5毫升的培养基。用不吸水的棉塞塞住试管或用金属盖盖住试管。在121°C下进行10分钟的高压灭菌。尽快冷却。请注意采取适当的预防措施以确保安全。 灭菌 在整个实验过程中，保持冷却条件的均匀性。将试管冷却至室温后，除空白管外，向每个试管中加入1滴接种液。轻轻摇匀整个试管架。在37°C下孵育18至24小时。孵育结束后，将试管在121°C下进行灭菌处理，并通过浊度法测定生长情况。使用紫外分光光度计在650纳米波长处测量各试管的浊度（以未接种的空白培养基为对照）。读取数据前，先充分混合每个试管的内容物。根据标准浊度值，在线性坐标纸上绘制剂量-反应曲线，并通过插值法估算样品的效力。

计算；核算