1.0 所需设备
LAF加热块
环状混合物
微量移液器
所需材料2.0
CSE**裂解物**
LRW
去热原处理过的稀释管，尺寸为12毫米×75毫米。
去热原处理过的检测管，尺寸为10毫米×75毫米。
单独包装的无菌、无内毒素微针头
3.0 程序
3.1 一般要求
3.1.1 按照BET用玻璃器皿的去热原处理SOP，对所有所需的玻璃器皿进行清洗和去热原处理。3.1.1 将所有内容转移至 无热原 将玻璃器皿运输到BET实验室。
3.1.2 按照要求将加热块“打开”（Switch the heating block “ON” as per the instructions). 加热块操作指南的标准操作规程（SOP） 并将温度设定为37°C。
3.1.3 使用以下公式计算样品的 MVD（最小有效剂量）：
产品中的内毒素限量 × 制剂的效力
MVD = ---------------------------------------------
ʎ, 裂解物敏感性
3.1.4 用稀释缓冲液（LRW）将待测样品稀释至其半最小检测浓度（half MVD），然后摇匀。 涡旋振荡器 持续3分钟。
3.2 控制标准品的制备（CSE）
3.2.1 重新配制；溶解 CSE 按照制造商在提供的瓶子和证书中的说明，在LRW（缓冲液）中操作，并使用涡旋器搅拌5至10分钟。3.2.2 重新配制后的CSE应在4周内使用。重新配制后的CSE应储存在2°C至8°C的温度范围内。
3.2.3 用实验室用水（LRW）配制一份浓度为1 EU/ml的稀释液，并在涡旋混合器中振荡该稀释液5分钟。
3.2.4 准备一个浓度为 4ʎ 的溶液：将 1 EU/ml 的溶液稀释至所需体积，然后使用涡旋振荡器振荡 5 分钟。其中，4ʎ 的具体浓度需要根据 lʎ 的值进行反算（4ʎ 的计算基于裂解物的灵敏度）。
3.3 溶液的复溶
3.3.1 现在重新配制（该溶液/制剂）。 **溶菌液** 使用无菌刀片打开裂解液的铝封。3.3.2 将裂解液粉末轻轻敲击在硬表面上，使其收集到小瓶的底部。然后缓慢打开瓶塞。
3.3.3 按照制造商的说明，在使用前加入稀释液（LRW），并立即更换软木塞。
3.4 标签上标注的裂解物灵敏度的确认
3.4.1 在使用前，需通过四次重复实验确认裂解液溶液的灵敏度值（标记为 l），该灵敏度值以 EU/ml 或 IU/ml 为单位进行表示。当使用新的裂解液批次，或者实验条件发生可能影响测试结果的变化时，必须对裂解液的灵敏度进行重新确认。3.4.2 从浓度分别为 2μg/mL、1μg/mL 和 0.5μg/mL 的 CSE 溶液中制备稀释液。具体方法是将这些 CSE 溶液用水进行系列稀释，以获得浓度分别为 2μg/mL、1μg/mL 和 0.25μg/mL 的 CSE 溶液。
3.4.3 取10个经过去热原处理的检测管，对每个管子进行编号并排列成四联组，然后按照下表中的步骤进行操作。
样品
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使用了CSE稀释液。
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LRW
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溶菌液（体积单位：毫升）
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重复次数
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2ʎ
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100毫升的2ʎ
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-
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100毫升
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4
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ʎ
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100毫升的ʎ
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-
|
100毫升
|
4
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0.5ʎ
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100毫升，浓度为0.5μg/ml的溶液
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-
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100毫升
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4
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0.25ʎ
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100米长的0.25微米纤维
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-
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100毫升
|
4
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NWC
|
-
|
100毫升
|
100毫升
|
4
|
3.4.5 向每个试管中加入100毫升复溶后的裂解液，然后轻轻混合。
3.4.6 将反应混合物在37° ± 1°的温度下恒温孵育60 ± 2分钟，期间避免振动。
3.4.7 孵育结束后，取出每个试管，直接从培养箱中取出并一次性将其倒置约180°。如果形成了一个牢固的凝胶并且在倒置后仍然保持原位，则记录结果为阳性。如果没有形成完整的凝胶，则结果为阴性。
3.4.8 除非标准溶液的最低浓度在所有重复试验中均显示阴性结果，否则该测试无效。
3.4.9 终点是指在内毒素浓度逐渐降低的一系列检测结果中最后一个呈阳性的结果。计算这些终点浓度的对数值的平均值，然后使用以下公式计算该平均值的反对数：
3.4.10 几何平均终点浓度是指裂解液溶液的测量灵敏度（单位为 EU/ml 或 IU/ml）。如果该浓度不低于 0.5ʎ 且不高于 2ʎ，则确认该标记的灵敏度有效，并将其用于使用该裂解液进行的测试中。
3.5 测试程序
3.5.1 按照表1中的说明，配制溶液A、B、C和D。表1
溶液；配方；解决办法
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溶液描述
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LRW（液体残留物）以毫升（ml）为单位
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4ʎ （CSE）以毫升（ml）为单位
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产品含量为 MVD/2 毫升。
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溶菌液（体积单位：毫升）
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重复次数
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A
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不合格产品控制（Negative Product Control, NPC）
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50
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-
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50
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100
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2
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B
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阳性产品对照（Positive Product Control, PPC）
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-
|
50
|
50
|
100
|
2
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C
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阳性水对照（Positive Water Control, PWC）
|
50
|
50
|
-
|
100
|
2
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D
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阴性对照水（Negative Water Control, NWC）
|
100
|
-
|
-
|
100
|
2
|
3.5.3 在PPC和PWC中各加入50毫升LRW（缓冲液），在NWC中加入100毫升LRW。立即加入50毫升产品样品（该样品已在NPC和PPC中稀释至MVD/2的浓度），随后再加入50毫升CSE（该溶液已在PPC和PWC中稀释至4ʎ的浓度）。
3.5.4 最后，在所有试管中加入100毫升裂解液，然后手动混合这些试管，并将它们放入加热块中孵育。加热块的温度应保持在37 ± 1°C，孵育时间为60 ± 2分钟。
3.6 结果的解释
3.6.1 在凝胶凝块法中，每个试管的结果被判定为阳性或阴性。阳性结果表示形成了坚固的凝胶，这种凝胶在试管倒置180°后仍能保持其完整性。3.6.2 阴性测试的特征是：没有凝胶形成，或者形成了粘性物质，但当试管倒置180°时，这种粘性物质会散开。
3.6.3 该测试结果无效，除非两个阳性对照溶液B和C的两个重复检测结果均为阳性，而阴性对照溶液D的检测结果均为阴性。
3.6.4 当溶液A的两个重复检测结果均为阴性时，所检测的制剂符合测试要求。
3.6.5 如果溶液A的两个重复检测结果均为阳性，则该溶液不符合测试要求。
3.6.6 如果溶液A的一个重复实验结果呈阳性，而另一个重复实验结果呈阴性，则需要重新进行测试。如果在重新测试中，溶液A的两个重复实验结果均呈阴性，则被检测的制剂符合该测试要求。
3.7 故障调查
3.7.1 当测试制备的两个试管均显示阳性结果时，通过检查以下参数来调查其失败的原因。3.7.2 检查产品稀释液、细胞悬浮液（CSE）稀释液以及裂解物稀释液的浓度。
3.7.3 玻璃器皿是否已经清洗干净…… 根据标准操作规程（SOP）进行脱氢处理。.
3.7.4 检查裂解物批次（Lysate lot）及其匹配的对照标准品（CSE）的灵敏度报告。
3.7.5 检查加热块的温度，并 校准.
3.7.6 检查 微量移液器校准.
3.7.7 检查任何来源的…… 污染；杂质 由于微生物学家的原因而发生。
4.0 注意事项
4.1 始终使用新鲜复溶的裂解物。4.2 重新水化的CSE可以在2至8°C的温度下储存28天。
4.3 提供的检验报告书（COA）是针对特定裂解物批次（lysate lot）和细胞悬浮液批次（CSE lot）的。因此，请使用相同的批次进行测试。
4.4 不要使用涡旋方式裂解细胞。
5.0的频率
5.1 按批次进行。5.2 每日进行 WFI（Water for Injection） 从所有用户的角度来看。
5.3 溶液灵敏度的确认 – 每批货物均需进行确认。
6.0 缩写
标准操作规程（SOP）BET：细菌内毒素检测
CSE：内毒素控制标准
MVD：最大有效稀释度
LRW：Lal试剂用水
PPC：阳性产品对照品
NPC：不合格产品控制
PWC：阳性水对照
NWC：阴性水对照