1.0 引言
当对任何产品首次进行无菌检查时，必须通过验证来确认所使用的检测方法的有效性。 回收；恢复；复苏；挽回 在产品存在的情况下，仅有少量的微生物。2.0 目标
本次验证的目的是为了提供书面证据，证明通过……方法进行的无菌检查是有效的。 膜过滤 只要按照标准操作规程（SOP）进行分析，该方法就能产生一致的结果。3.0 范围
本方案适用于该产品的无菌检查。4.0 职责
S. No.
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职责；任务；责任
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部门名称
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1
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验证方案的编制
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质量控制
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2
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方案执行
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质量控制
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3
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方案和报告的批准
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质量保证
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4
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最终系统批准
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质量保证/质量控制主管
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5
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报告的审核与维护
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质量控制
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5.0 先决条件
为了高效地执行过滤法无菌检查的验证工作，请确保满足以下要求：经过验证的无菌生产设施，用于进行无菌检查（Sterility Test Validation）。
2. 所有用于无菌检查验证的设备均已通过确认（qualification），并且相应的标准操作规程（SOP）已经制定并得到严格执行。
3. 所有用于无菌检查验证的设备以及培养基都必须是无菌的。
4. 经过培训的人员负责进行无菌检查及其验证工作。
5. 膜过滤器：单独包装的无菌硝酸纤维素或醋酸纤维素膜，直径47毫米，平均孔径0.45微米。
6. 经过灭菌处理的过滤装置、镊子和剪刀
无菌的 70%异丙醇溶液
6.0 设备/系统描述
1
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地点；位置
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质量控制部门的无菌室
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2
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设备
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该设备涵盖了……（The equipment includes all the necessary components for……） 不锈钢 配备歧管、真空泵、高压灭菌器、热风烘箱、层流空气系统和培养箱的过滤装置。
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7.0 关键控制参数/监测参数的识别
在进行无菌检查的验证之前，需要检查以下参数：7.1 根据标准操作规程（SOP），每批用于制备无菌检查培养基的脱水培养基都必须进行促生长能力的检测。
7.2 在验证过程中，按照标准操作规程（SOP）进行环境监测（使用沉降平板法），以及人员监测（采用手指点触和拭子采样方法）。
7.3 如果在LAF（层流柜）和Finger dab（手指采样）的监测过程中观察到任何菌落形成单位（cfu），则必须对所有检测到的菌落形成单位进行处理。 鉴定到物种水平.
8.0 取样细节
1. 进行取样工作。 连续三批产品 从灭菌器装载物中的各个部位采集样本。2. 立即进行泄漏测试，并目视检查瓶子是否有泄漏或异物颗粒。
S. No.
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产品名称
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批号
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批量大小
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取样日期
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抽取了样品的瓶子。
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由...取样
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签名；署名
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1.
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|||||||
2.
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|||||||
3.
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9.0 验证测试
采用膜过滤法进行无菌检查的验证，需按照相关程序进行操作。A. 残留抗菌活性检测
“残留检测” 抗菌活性 按照一般无菌检查的描述进行测试程序，直至最后的洗涤步骤。在最后一次洗涤过程中，加入特定细菌和真菌的活细胞接种物。当含有这些微生物的最终洗涤液通过过滤器后，将滤纸接种到FTM培养基中，并在30至35ºC下培养；或者按照表1的要求，在SCDM培养基中于20至25ºC下培养。每种添加的微生物的生长情况应在48小时内显现出来。如果细菌在3天内、真菌在5天内没有明显生长，那么该测试程序无效，必须进行修改。
B. 抗微生物活性测试
为了证明该混合物没有抗菌活性，需按照无菌检查程序进行测试，直至培养步骤。然后分别向FTM和SCDM中加入特定细菌和真菌的活细胞接种物，并分别在30至35ºC和20至25ºC的温度下进行培养。每种添加的微生物都应在48小时内显示出明显的生长迹象。如果细菌在3天内、真菌在5天内没有明显生长，则该测试程序无效，必须进行修改。
C. 静止期试验（培养期结束时试验培养基的有效性）
“Stasis Test”的目的是为了证明：接种了测试样品的培养基（即FTM和SCDM）能够在整个培养期间维持微生物的生长。在按照说明书要求完成培养基的培养后…… 无菌检查 对于阴性对照管，向已经培养在30-35ºC下的FTM（培养基）中加入特定细菌的活细胞接种物；对于下一个含有SCDM（培养基）的试管，向其中加入已经培养在20-25ºC下的特定真菌的活细胞接种物。将所有接种后的试管重新放回原来的温度下继续培养。所有试管应在48小时内显示出添加的微生物的生长情况。如果细菌在3天内、真菌在5天内没有明显生长，则该测试被视为无效。
A. 残留抗菌活性检测
目标：
该测试的目的是确保：通过本方案中提到的步骤，能够充分消除任何残留的抗菌活性。程序；步骤；操作规程
步骤；步骤
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阳性产品对照（Positive Product Control）
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† 阴性产品对照（Negative Product Control）
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阳性对照
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阴性对照
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1
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用约15毫升的无菌蛋白胨水冲洗膜。
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用大约15毫升的无菌蛋白胨水冲洗膜。
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取四支FTM试管和三支SCDM试管。
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用大约15毫升的无菌蛋白胨水冲洗膜。
|
2
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随机选取20瓶样品，将每瓶内容物的半量（如果是SVP（特殊包装规格），则取整瓶内容物）倒入过滤器支架中，然后开始过滤操作。
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随机选取20瓶样品，取出每瓶内容物的半量（如果是SVP（特殊包装）则取出整个容器内的内容物），将其倒入过滤器支架中，然后开始过滤操作。
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在每个试管中加入10-100个菌落形成单位（cfu）的培养物，这些培养物列在表1中。
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用100毫升无菌蛋白胨水冲洗膜。
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3
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用200毫升的蛋白胨水冲洗膜两次。
|
用200毫升的蛋白胨水冲洗膜两次。
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将SCDM管在20-25℃的温度下孵育。ºC代表NMT（Non-Microbial Test）需在5天内完成；FTM（Final Test Method）管需要在30-35℃的温度下保存。ºC代表NMT 3天。
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使用无菌的手术剪刀将滤纸无菌切割成两半，然后将其中一半转移到无菌的FTM培养基中，另一半转移到无菌的SCDM培养基中。
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4
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用100毫升含有10-100个表1中列出的任意一种阳性菌株细胞的蛋白胨水冲洗膜。
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最后，用100毫升的无菌蛋白胨水冲洗膜。
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NA
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将SCDM管在20-25℃的温度下孵育。ºC和FTM管，温度为30-35℃º“C for 14 days”可以翻译为“连续14天”。
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5
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将整个膜接种到相应的培养基试管中，并进行适当的标记。对于表1中列出的其他微生物菌株，重复相同的操作步骤。
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使用无菌的手术剪刀将滤纸无菌切割成两半，然后将其中一半转移到无菌的FTM培养基中，另一半转移到无菌的SCDM培养基中。
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NA
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NA
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6
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将SCDM管在20-25℃下孵育。ºC代表NMT（Non-Microbial Test）持续5天，FTM（Final Test Method）管在30-35℃的条件下进行。ºC代表NMT 3天。
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将SCDM管在20-25℃下孵育。ºC和FTM管，温度为30-35℃。º“C”代表14天。
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NA
|
NA
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表 - I
“Sr. No.” 可以翻译为“高级编号”或“资深编号”。这个术语通常用于表示在某个系统、列表或文件中具有较高优先级或级别的编号。例如，在药品生产质量管理规范（GMP）的文件体系中，可能会使用“Sr. No.”来标识重要的或优先级较高的条款或文件。
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阳性对照
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流式硫代葡萄糖酸盐培养基
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大豆酪蛋白消化培养基
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1
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阳性对照 – I
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） NCIM 2079
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C. albicans NCIM 3471
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2
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阳性对照品 – II
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**Ps. aeruginosa**
（注：此为专有名词，通常指“铜绿假单胞菌”，在制药和生物技术领域中常用。中文可译为“铜绿假单胞菌”或“铜绿菌”。） NCIM 2200
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A. 尼日尔 NCIM 1196
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3
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阳性对照品 – III
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B. subtilis NCIM 2063
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环境菌群– EF II
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4
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阳性对照品 – 静脉注射（IV）
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环境菌群 – EF I
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验收标准
如果在3天内观察到细菌的明显生长，在5天内观察到真菌的生长，并且阳性产品对照容器中每种挑战微生物的生长情况与阳性对照中的生长情况相似，同时阴性对照和阴性产品对照中均无生长，则说明该产品在测试条件下不具有抗菌活性，或者其抗菌活性已被有效消除。此时，可以常规进行无菌测试，无需进一步修改。2. 如果细菌在3天内、真菌在5天内没有出现明显生长；或者阳性产品对照容器中的每种测试微生物的生长情况与相应的阳性对照容器相比有显著差异，说明该产品具有抗菌活性，并且这种活性在测试条件下未能被有效消除。需要调整测试条件以消除抗菌活性，然后重新进行验证测试（例如通过增加清洗次数）。
阴性产品对照试验
产品控制测试结果为阴性有助于解释无菌测试的结果，尤其是在因该结果而宣布测试无效的情况下。 污染；杂质 在阴性对照品控制中，阴性对照品的核心要素是模拟实际检测方法。B. 抗微生物活性测试
目标
该测试的目的是确保在实验条件下不存在抗菌活性。程序；步骤；操作规程
步骤编号
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产品控制
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阳性对照
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阴性对照
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1
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用约15毫升的无菌蛋白胨水冲洗膜。
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NA
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阴性对照I
用约15毫升的无菌蛋白胨水冲洗膜。
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2
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随机选取20瓶样品，取出每瓶内容物的半量（如果是SVP（特殊包装形式），将整个容器内的内容物全部取出）放入过滤器支架中，然后开始过滤操作。
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NA
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用100毫升无菌蛋白胨水冲洗膜。
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3
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用3次、每次100毫升的蛋白胨水冲洗膜。
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NA
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使用无菌的手术剪刀将滤纸无菌切割成两半，然后将其中一半转移到无菌的FTM培养基中，另一半转移到无菌的SCDM培养基中。
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4
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使用无菌不锈钢剪刀将滤纸无菌切割成两半，然后将其中一半转移到无菌FTM中，另一半转移到无菌SCDM中。
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NA
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将SCDM管在20-25℃的温度下孵育。ºC和FTM管，温度为30-35℃。º“C for 14 days”可以翻译为“持续14天”。这里的“C”可能是某个特定代码、标识或缩写的代表，具体含义需要根据上下文来确定。
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5
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对表1中列出的其余微生物菌株，重复相同的操作程序。
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NA
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NA
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6
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将SCDM管在20-25℃下孵育。ºC和FTM管，温度为30-35摄氏度。º“C for 14 days”可以翻译为“连续14天”。这个短语通常用于表示某个过程或状态需要持续14天的时间。
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NA
|
NA
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7
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培养结束后，观察试管中的生长情况。如果没有生长现象，则表示没有细菌或微生物生长。
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NA
|
NA
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8
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在培养14天后，分别向FTM和SCDM试管中加入表1中列出的活菌接种物（10至100个细胞）。
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取四支FTM试管和三支SCDM试管。
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阴性对照II
取一支FTM和一支SCDM试管。
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9
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将所有接种后的试管恢复到之前的温度，继续培养：FTM培养3天，SCDM培养5天。
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在每个试管中加入10-100个菌落形成单位（cfu）的表1中列出的菌种。
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向每个试管中加入10-10毫升的无菌注射用水（WFI）。
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10
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NA
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将SCDM管在20-25℃的温度下孵育。ºC代表NMT（Non-Microbial Test）持续5天，FTM（Final Test Method）管需要在30-35℃的温度下保存。ºC代表NMT 3天。
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将SCDM管在20-25℃下孵育。ºC培养5天，FTM管在30-35℃下保存。ºC for 3 days.
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验收标准
1. 在产品控制中，每种添加的微生物的生长情况应在3天内对于细菌可见，在5天内对于真菌可见，并且其生长结果应与阳性对照结果相当。2. 如果细菌在3天内没有生长，真菌在5天内没有生长，则该测试程序无效，必须进行修改（例如增加清洗步骤），直到在上述条件下能够观察到生长现象为止。
3. 阴性对照中不应出现生长现象。
C. STASIS TEST（培养期结束时的测试介质有效性）
引言
“Stasis Test”的目的是为了证明：接种了测试样品的培养基（即FTM和SCDM）能够在整个培养期间支持微生物的生长。同时，还需要证明这些培养基的促生长特性在整个测试期间保持稳定且不受影响。目标
该测试的目的是确保流体硫代甘氨酸盐（fluid thioglycollate）和豆酪蛋白消化培养基（Soybean casein digest medium）的促生长特性在整个测试期间保持稳定。程序；步骤；操作规程
进行FTM（4管）和SCDM（3管）的阴性对照实验，同时进行“抗菌活性残留检测”和“无接种情况下的抗菌活性检测”，直至培养期结束。2. 孵育完成后，观察每种培养基（FTM和SCDM）的阴性对照，确保没有微生物生长。
3. 在确认没有微生物生长后，按照表 I 中的描述，向各自的试管中无菌添加 10 至 100 个活的微生物细胞。
4. 将试管恢复到之前的温度，继续培养：细菌培养不少于3天，真菌培养不少于5天。
5. 观察：每天通过观察试管的浑浊度来检测是否有微生物生长的迹象。
验收标准
如果观察到的每种添加的微生物在3天内（对于细菌）或5天内（对于真菌）都未生长，则该测试结果有效。2. 如果细菌在3天内没有生长，真菌在5天内没有生长，则该测试被视为无效。
10.0 细胞悬浮液的制备方法
10.1 根据要求，在锥形瓶中配制大豆酪蛋白消化琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。 《介质制备标准操作规程》.10.2 用蒸馏水配制0.9%（重量/体积）的氯化钠溶液，并按以下方式分装到试管中： - 9毫升生理盐水中加入5个试管； - 45毫升生理盐水中加入1个试管； - 90毫升生理盐水中加入3个试管。 用棉塞封住试管口，然后在121ºC的高压灭菌器中灭菌20分钟。
10.3 将灭菌后的培养皿放入热风烘箱中，在180ºC下加热1小时。
10.4 执行以下活动： 系列稀释 在微生物实验室（或洁净室）里。
10.5 从冰箱中取出培养物（MC1/M1/W1/D1），使其恢复到室温。
10.6 将1毫升无菌生理盐水转移到新鲜培养的斜面上，使用接种环混合后，将其悬浮在9毫升无菌生理盐水中。通过轻轻摇晃使悬浮液均匀。
10.7 准备系列稀释液（每次将1毫升培养悬浮液用9毫升生理盐水稀释），直至达到10个稀释度。-4 “稀释，从10开始”-4 取5毫升样品，然后加入45毫升无菌生理盐水中（浓度为10%）。-5）以及从10开始-5 取10毫升样品，然后加入90毫升无菌生理盐水中（10%）。-6重复该程序，直到达到10次为止。-8 稀释。
10.8 保留原始未稀释的培养悬浮液及 10-5 达到10-8 将溶液在2ºC至8ºC的冰箱中冷藏保存（进行稀释）。
10.9 无菌条件下分别量取1毫升的10种物质。-3 达到10-8 将每种微生物分别稀释后，接种到每个经过灭菌处理的干燥培养皿中。
10.10 无菌条件下，向每个培养皿中倒入约20毫升灭菌后的大豆酪蛋白消化琼脂培养基（用于细菌培养）和灭菌后的沙氏葡萄糖琼脂培养基（用于真菌培养）。这两种培养基事先已液化并冷却至约45ºC，混合后让其固化。将培养皿置于32.5±2.5ºC的温度下培养24至48小时（用于细菌培养），或置于22.5±2.5ºC的温度下培养48至72小时（用于真菌培养）。
10.11 在培养结束后，统计每个培养皿上形成的菌落形成单位（Colony Forming Units, CFU）的数量。
10.12 选择含有10-100 cfu/ml的培养液悬浮液，并将其保存在2ºC至8ºC的冰箱中。
10.13 在无菌检查验证中，应使用每毫升含有约100个每种微生物细胞的悬浮液进行测试。
2. 验证测试应在无菌检测室进行，而阳性对照测试应在配备层流空气（LAF）的微生物检测室中进行。
3. 进行无菌检测或相关无菌操作的人员应穿戴 灭菌服装.
4. 所有用于无菌检查验证的设备、容器和材料都必须通过高压灭菌或干热灭菌进行消毒。
10.9 无菌条件下分别量取1毫升的10种物质。-3 达到10-8 将每种微生物分别稀释后，接种到每个经过灭菌处理的干燥培养皿中。
10.10 无菌条件下，向每个培养皿中倒入约20毫升灭菌后的大豆酪蛋白消化琼脂培养基（用于细菌培养）和灭菌后的沙氏葡萄糖琼脂培养基（用于真菌培养）。这两种培养基事先已液化并冷却至约45ºC，混合后让其固化。将培养皿置于32.5±2.5ºC的温度下培养24至48小时（用于细菌培养），或置于22.5±2.5ºC的温度下培养48至72小时（用于真菌培养）。
10.11 在培养结束后，统计每个培养皿上形成的菌落形成单位（Colony Forming Units, CFU）的数量。
10.12 选择含有10-100 cfu/ml的培养液悬浮液，并将其保存在2ºC至8ºC的冰箱中。
10.13 在无菌检查验证中，应使用每毫升含有约100个每种微生物细胞的悬浮液进行测试。
11.0 注意事项
验证工作必须由经过培训的人员使用适当的技术和设备来进行，以确保尽量减少测试过程及测试环境受到意外微生物污染的风险。2. 验证测试应在无菌检测室进行，而阳性对照测试应在配备层流空气（LAF）的微生物检测室中进行。
3. 进行无菌检测或相关无菌操作的人员应穿戴 灭菌服装.
4. 所有用于无菌检查验证的设备、容器和材料都必须通过高压灭菌或干热灭菌进行消毒。